牛冷凍胚胎解凍后能直接移植給受體牛的胚胎冷凍保存方法，對在商業條件下應用胚胎移植技術最有價值。傳統冷凍法通常在胚胎解凍后用蔗糖溶液分步脫除搞凍劑后方能移植，而直接移植法簡化了移植前胚胎的處理，不公可消除由于脫去搞凍劑所帶來的技術誤差，而且操作簡便、省時、不需專門設備與器械，就象細管冷凍精液輸精一樣，胚胎解凍后可立即移植。實現上述目的的關鍵問題是尋求一種對胚胎具有滲透性高的抗凍劑，以使胚胎解凍后直接復水，并獲得較高的活力。為此，有人曾選用甘油和蔗糖混合液一步解凍（Massip等，1984），又有人用丙二醇（SuzuKi等，1992）作為抗凍劑冷凍牛胚胎，解凍后直接在PBS中復水脫除抗凍劑。陽年生等（1996）對胚胎一步脫除抗凍劑的冷凍方法也進行了深入的試驗研究。然而，到目前止，大多數研究采用的是牛體外受精胚胎，在國內善于體骨受精的胚胎用不同抗凍劑冷凍－解凍后直接移植的效果迄今報道少見。本研究目的是確定乙二醇或丙二醇作為抗凍保護劑冷凍－－解凍牛體內膛胎進行體外培養，以及在生產條件下直接移植的效果。
1材料與方法
1.1胚胎體內生產
試驗以天津市奶 牛育種站飼養的荷斯坦泌乳母牛為供體。自然發情后第9～13天用高活必FSHP（中國科學院動物研究所研制）配合PG（上海計劃生育研究所生產）進行超數排卵處理。超排發情后間隔10～12小時以美國、加拿大純種公牛細管凍精輸精2～3次。授精后第7或第8天用全封閉自動沖卵裝置（FHK，日本，富士平工業公司）進行非手術采卵。回收的沖卵液經經孔徑為0.75微米的胚胎過濾器濾過后，將少量殘液置于20～40倍實體顯微鏡下檢出胚胎，在NiKon倒置鏡下按形態學分類法評定胚胎品質。選擇A級或B級緊縮桑椹胚或囊胚用于冷凍試驗。
1.2胚胎在含20％FCS（胎犢血清）的M－PBS液中清洗3次后分別按下述冷凍和解凍方法處理。（1）直接移植法：按2種抗凍劑分組：①組為1.8M乙二醇（EG）；②組為1.6M丙二醇（PD）。在室溫下將胚胎一步移入1.8M乙二醇＋M－PBS＋20％FCS或1.6M丙二醇＋M－PBS＋20％FCS的冷凍液中，隨后裝入0.25毫升塑料細管，胚胎在冷凍液中至上機冷凍前的平衡時間為10～20分鐘。在－7℃，將胚胎直接放入程控冷凍儀（ET－1型，FHK，富士平工業公司）的灑精浴槽內，2分鐘后植冰，在－7℃下停留8分鐘。然后以0.3℃／分的速率降溫至－30℃，取出胚胎細管，直接投入液氮中保存。解凍時，從罐中取出細管在空氣中停留5～10秒鐘后，浸入30℃水浴中（見冰晶消失為止），然后將胚胎直接注入含M－PBS＋20％FCS液的皿內，15分鐘后用該液清洗2次。
（2）常規法（對照組）：使用的抗凍劑為1.4M甘油（Gly）。在室溫下將胚胎分步移入0.5M、1.0M和1.4M甘油＋M－PBS＋20％FCS的冷凍液中，每步停留10分鐘。然后將胚胎移入1.4M甘油冷凍液中停留10分鐘。然后將胚胎裝入1.4M甘油冷凍液停留10分鐘后裝入細管內。在－5.3℃，將胚胎直接放入冷凍儀內，植冰與降溫等程序均與1法相同。在37℃水浴中解凍后，將胚胎依次移入1.0M甘油+0.3M蔗糖、0.5M甘油＋0.3M蔗糖和0.3M蔗糖＋M－PBS＋20％FCS的解凍液中分步脫除抗凍劑每步停留10分鐘。最后用M－PBS＋20％FCS液清洗2次。
1.3體外培養與膛胎存活力評定將脫除抗凍劑的各組胚胎移入預先覆蓋礦物油的TCM－199＋20％FCS培養小滴中，置CO2培養箱（溫度：38℃；CO2：5％）內培養24～48小時，發育至下一階段且形態好的胚胎判為存活胚胎。
1.4移植及妊娠診斷：受體來自靜海縣奶類項目辦實驗牛場和市奶牛發展中心飼養的荷斯坦良成母牛及部分成年母牛。選擇自然發情或經PG處理后同期發情、生殖器官無異常、黃體發育良好的母牛作受體。和直接移植法和常規法冷凍保存數日的胚胎攜農場解凍后分別做如下處理：前者不脫除搞凍劑，直接移植；后者分步脫除抗凍劑后，按常規操作非手術移植到子宮角深部。移植后60～90天通過直腸檢查診斷妊娠。
2結果與結論：冷凍保存體內胚胎共191枚，解凍其中的96枚進行培養，48小時后各組胚胎的發育情況見表1。
表1不同冷凍方法及不同抗凍劑冷凍－解凍體內胚胎后體外培養結果
冷凍方法 抗凍劑種類
及其濃度 冷凍
胚胎數 解凍
培養胚數 存活
胚胎數 存活率（％）
直接移 1.8M乙二醇 34 33 28 84.8（a）
植法 1.6M丙二醇 32 29 19 65.5（b）
常規法 1.4M甘油 30 30 26 86.7（c）
注：卡方檢驗：a與bP<0.05，a與cP<0.05
用1.8M乙二醇作抗凍劑直接移植法冷凍－解凍胚胎組的存活率顯高于1.6M丙二醇組（84.8%比65.5%，P<0.05），而與對照組（1.4M甘油常規法）的存活率（86.7%）相近（P>0.05）。研究證明，抗凍保護劑對 牛胚胎的滲透性高低直接影響胚胎的損傷程度。許多人報道了乙二醇、丙二醇以及甘油與蔗糖混合作為抗凍劑冷凍牛胚胎，解凍后直接在PBS中復水，一步脫除抗凍劑的試驗效果。陽年生等人（1996）證明，用乙二醇或甘油＋蔗糖作抗凍劑冷凍牛體外受精胚胎，經一步脫除抗凍劑后的孵化率均明顯高于丙二醇（前者分別為73.24%和77.27%；后者為47.9%）。本試驗結果表明，用1.8M乙二醇冷凍牛體內胚胎，解凍后直接在M-PBS中一步脫除抗凍劑的體外存活率（84.8%）顯著高于1.6M丙二醇組（65.5％），與陽年生等人的結果相似。同時說明用乙二醇作抗凍劑不僅適用于體內胚胎冷凍，而且其效果優于丙二醇。
2.2為確定乙二醇或丙二醇冷凍－－解凍胚胎在母體內的發育率，在生產條件下比較兩者的直接移植效果。共解凍95枚胚胎，移植胺體91頭，其中妊娠42頭，移植妊娠率為46.2%，不同抗凍劑的移植結果見表2。
表2不同冷凍方法采用不同抗凍劑冷凍－解凍體內胚胎移植效果
冷凍方法 抗凍劑種類
及其濃度 解凍
胚胎數 移植
受體數 妊娠數移植妊娠率
（％）
直接移 1.8M乙二醇 33 33 16 48.5（a）
植法 1.6M丙二醇 30 30 12 40.0（b）
常規法 1.4M甘油 32 28 14 50.0（c）
注：卡方檢驗：a與bP<0.05，a與cP>0.05
以1.8M乙二醇為抗凍劑冷凍體內胚胎，解凍后直接移植的妊娠率為48.5％，顯著高于1.6M丙二醇組的40.0％，（P<0.05），但與對照組（1.4M甘油）的50.0％無明顯差異（P>0.05）。這與堂地修（1996）在生產條件下大群試驗結果相符，即1.6M丙二醇組的移植妊娠率低于1.8M乙二醇或1.4M甘油組（對照組），而乙二醇與甘油組之間的移植妊娠率無明顯差異。
2.3綜上所述，用乙二醇作抗凍劑按直接移植法冷凍－解凍牛胚胎獲得的體外與體內發育率與甘油冷凍分布復水常規法的結果相似，但前者簡單、方便、適于大面積推廣應用。據此，乙二醇是一種有效的冷凍保護劑，在生產條件下，牛冷凍胚胎的直接移植法可以接受。