作者：江蘇省淡水水產研究所 郝忱，萬金娟，沈美芳，薛暉，丁正峰，楊唯唯，史陽白
摘要:為了探討中草藥添加劑對克氏原螯蝦生長、非特異性免疫力及抗白斑病綜合征病毒感染的影響，選取600尾健康的克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，體質量為(7.70±0.07)g，隨機分為4組，其中1組為對照組(D1)，投喂基礎日糧，另外3組為試驗組，分別在基礎日糧中添加1.0%大黃(D2)、0.5%大黃+0.5%淫羊藿(D3)、0.3%大黃+0.3%淫羊藿+0.2%黃芪+0.2%板藍根(D4)。連續投喂60d后，檢測克氏原螯蝦生長和血清相關免疫酶指標，并統計克氏原螯蝦感染白斑病綜合征病毒(WSSV)后的成活率，綜合評價幾種中草藥添加劑對克氏原螯蝦的作用效果。結果表明，與對照組相比，D4組顯著提高了蝦體增質量率和特定生長率(P＜0.05)；D3和D4組顯著提高了銅藍蛋白(CP)的含量(P＜0.05)；3個試驗組蝦血清中白蛋白(ALB)、溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)水平均顯著提高，甘油三酯(TG)水平均顯著降低(P＜0.05)；而3個試驗組蝦血清中總蛋白質(TP)、酸性磷酸酶(ACP)以及過氧化物酶(POD)水平差異不顯著(P＞0.05)。中草藥添加劑組能顯著提高攻毒后蝦的成活率(P＜0.05)，其中D4組效果最好。綜上所述，在基礎日糧中添加中草藥復合添加劑(0.3%大黃+0.3%淫羊藿+0.2%黃芪+0.2%板藍根)可以促進克氏原螯蝦的生長，提高機體的非特異性免疫力以及抵抗白斑病綜合征病毒的能力。
關鍵詞:克氏原螯蝦；中草藥添加劑；生長；白斑病綜合征病毒
克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，隸屬甲殼綱(Cmstacea)十足目(Decapoda)螯蝦科(Cambaridae)原螯蝦屬(Procambarus)，因其肉質鮮美、營養豐富受到消費者青睞，是當今世界上最主要的淡水螯蝦養殖種類，其產量占整個螯蝦產量的70%～80%，也是中國目前重要的經濟水產養殖對象。近年來，克氏原螯蝦養殖規模逐年擴大，據統計，僅湖北省荊州地區養殖克氏原螯蝦的水面就已經達到數萬公頃。但隨著人工養殖面積的迅速擴大，病害的發生也越來越頻繁和嚴重。國內已相繼報道了克氏原螯蝦的螺原體病、爛鰓病等疾病，其中白斑綜合征病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)為一種無包涵體病毒，地理分布廣，流行范圍大，傳染性強，目前尚無有效治療途徑。近幾年以來，白斑綜合征病毒在克氏原螯蝦養殖中開始流行，并成為克氏原螯蝦養殖中的重要病害，給養殖業帶來巨大損失。
傳統上治療和預防克氏原螯蝦疾病主要依賴抗生素、化學藥物等，但這些藥物濫用容易造成環境污染、藥物殘留、病原微生物的耐藥性、免疫抑制和破壞機體微生態平衡等諸多負面影響，嚴重困擾著克氏原螯蝦的養殖。因此，提高動物自身的免疫力對解決養殖病害問題極為重要。天然中草藥取自于天然動植物產品，保持了其成分、結構的自然狀態和生物活性，作為飼料添加劑，不僅有補充營養、促進生長、增強體質、提高抗病力的作用，與化學添加藥劑相比，還具有低毒、低殘留、耐藥性不顯著等特點。因此中草藥添加劑已日益成為替代抗生素和化學合成藥物的新一代添加劑。大黃、淫羊藿、黃芪和板藍根是中國傳統中藥材，具有抗病毒、抗氧化、調節機體體液免疫、激活免疫因子等功效，但其尚存在單一使用的不足之處。目前已有一些關于大黃、淫羊藿、黃芪以及板藍根在水產養殖中少量使用的報道，但有關大黃、淫羊藿、黃芪和板藍根的配伍使用及其對克氏原螯蝦的影響還未見報道。因此，通過對克氏原螯蝦血清的測定及感染WSSV后死亡情況的研究，篩選促進生長和調節克氏原螯蝦非特異性免疫功能的中草藥免疫調節劑，可進一步為克氏原螯蝦免疫應答機理研究和提高其抗病能力提供科學依據，對克氏原螯蝦健康養殖和可持續發展具有重要意義。
1材料與方法
1．1試驗蝦、中草藥添加劑及日糧
克氏原螯蝦由江蘇省淡水水產研究所祿口基地提供。選擇健康、質量基本一致的蝦600尾，初始體質量(7.70±0.07)g。隨機分為4組，分別為對照組D1(投喂基礎日糧)、試驗組D2(基礎日糧添加1.0%大黃)、試驗組D3(基礎日糧添加0.5%大黃+0.5%淫羊藿)和試驗組D4(基礎日糧添加0.3%大黃+0.3%淫羊藿+0.2%黃芪+0.2%板藍根)，每組設3個重復，共12個水泥池(規格為2.5m×2.5m×0.8m)，每池放養50尾試驗蝦。大黃、淫羊藿、黃芪和板藍根購自安徽省亳州藥材市場，先粗粉碎，再經超微粉碎機粉碎，過120目篩網，混合機內充分混勻備用。各種飼料原料分別粉碎，充分混勻后，用SLP-45型膨化機(中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所產品)制成粒徑2.0mm的沉性顆粒飼料，50℃烘干后于4℃冰柜中保存備用。基礎日糧組成及主要營養成分見表1。
1．2飼養管理
克氏原螯蝦在江蘇省淡水水產研究所祿口基地水泥池馴化7d后投喂試驗日糧，每天投喂3次(8∶00、16∶00、22∶00)。日投餌量為蝦體質量的4%～6%，上午投餌量為日投餌量的30%，下午為30%，晚上為40%，并根據攝食、生長情況作適當調整。水泥池采用循環流水系統，飼養期間水溫27～32℃左右，pH為7．3～7.8，溶解氧大于6mg/L，氨氮小于0.01mg/L，硫化氫小于0.01mg/L。減少人為干擾，保持安靜，防止額外應激，每日觀察蝦攝食及死亡情況，發現死蝦及時撈出稱質量記數，并檢查死亡原因。正式養殖60d后結束，進行稱質量和采樣等。
表1試驗飼料配方及營養組成
1)復合預混料:1kg飼料含維生素E150.00mg、維生素K50.00mg、維生素B180.00mg、維生素B250.00mg、煙酸150.00mg、泛酸150.00mg、維生素B650.00mg、生物素1.00mg、維生素B120.02mg、葉酸10.00mg、維生素C300IU、維生素A10000IU、維生素D2000IU、硫酸銅2.00g、硫酸鐵25.00g、硫酸鋅22.00g、硫酸錳7.00g、亞硒酸鈉0.04g、碘化鉀26.00mg、氯化鈷0.10g。
1．3采樣與處理
60d飼養試驗結束后，禁食24h，將各池蝦稱質量計數。每池隨機選取10尾蝦，用1ml的一次性注射器從蝦的頭胸甲后部刺入心臟，抽取血液，并置于4℃冰箱中過夜；以4℃5000r/min離心10min，取上清液作為待測血清，－20℃凍存備用。
1．4攻毒試驗
采樣結束后，從各水泥池剩余的蝦中再選取體質量基本一致的克氏原螯蝦進行攻毒試驗，每個池取30尾蝦。采用江蘇省淡水水產研究所提供的白斑綜合征病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)，按照Mai等所述方法制備WSSV病毒液，每尾蝦肌肉注射病毒液0.1ml。然后分別放養于室內養殖箱(規格為1.0m×0.4m×0.4m)中，保證充足的溶氧。觀察注射WSSV病毒后的蝦生理活動和死亡情況，并分別于0h、12h、24h、36h、48h、60h統計成活率。
1．5測定指標與方法
1．5．1生長指標分別按下列公式計算增質量率(WG)、特定生長率(SGR)、餌料系數(FCR)、成活率(SR):增質量率(WG)=100×(Wt－W0)/W0，特定生長率(SGR)=100×(LnWt－LnW0)/t，餌料系數(FCR)=FI/(Wt－W0)，成活率(SR)=100×Nt/N0，式中W0為魚初體均質量，Wt為魚末體均
質量，t為飼喂天數，FI每尾魚平均攝食飼料總量(風干樣質量)，N0為試驗開始時尾數，Nt為試驗結束時尾數。
1．5．2血液指標選用白蛋白(ALB)、銅藍蛋白(CP)、總蛋白質(TP)、一氧化氮(NO)和甘油三酯(TG)含量，以及酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、總超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性作為非特異性免疫指標。ALB、CP、TP、NO和TG含量以及ACP、LZM、SOD和POD的活性采用相關試劑盒進行測定，試劑盒均購自南京建成生物研究所。
1．6數據統計與分析
試驗數據用SPSS16．0統計軟件包中的單因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏多重比較，檢驗各組間的差異。
2結果與分析
2．1中草藥添加劑對克氏原螯蝦生長性能的影響
從表2可見，與對照組相比，D4組克氏原螯蝦的增質量率和特定生長率均顯著提高(P＜0.05)，其中增質量率提高了27.58%，特定生長率提高了15.30%。各組間餌料系數和成活率無顯著差異(P＞0.05)。
2.2中草藥添加劑對克氏原螯蝦血液生理生化指標的影響
與對照組相比，D2、D3和D4組蝦血清白蛋白的水平均顯著增加(P＜0.05)(表3)，分別增加了31.40%、49.00%和42.43%；D3和D4組蝦血清銅藍蛋白含量較對照組顯著提高了28.17%和27.38%(P＜0.05)。3個試驗組蝦血清甘油三酯的水平均顯著低于對照組(P＜0.05)。各組間總蛋白質含量沒有顯著差異(P＞0.05)。
表2中草藥添加劑對克氏原螯蝦生長性能的影響
D1(對照):投喂基礎日糧；D2:在基礎日糧中添加1.0%大黃；D3:在基礎日糧中添加0.5%大黃+0.5%淫羊藿；D4:在基礎日糧中添加0.3%大黃+0.3%淫羊藿+0.2%黃芪+0.2%板藍根。同一列中不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0.05)。
表3中草藥添加劑對克氏原螯蝦血液生理生化指標的影響
各處理見表2注。同一列中不同小寫字母表示組間差異顯著(P＜0．05)。
2．3中草藥添加劑對克氏原螯蝦相關免疫酶活性的影響
從圖1可見，與對照組相比，3個試驗組蝦血清溶菌酶、超氧化物歧化酶水平均顯著提高(P＜0.05)，其中溶菌酶水平分別提高了92.67%(D2)、86.50%(D3)、96.36%(D4)，超氧化物歧化酶水平則分別提高了25.91%(D2)、14.29%(D3)、38.32%(D4)。此外，3種中草藥添加劑對蝦血清酸性磷酸酶和過氧化物酶水平的影響不大(P＞0.05)。
各處理見表2注。
圖1中草藥添加劑對克氏原螯蝦相關免疫酶活性的影響
2．4中草藥添加劑對克氏原螯蝦抗白斑綜合征病毒(WSSV)感染的影響
克氏原螯蝦人工注射感染WSSV后，D4組蝦的成活率在48h時顯著高于對照組，3個試驗組蝦的成活率在60h均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中D4組效果最好，成活率分別比對照組提高了18.75%(48h時)、70.00%(60h時)(圖2)。各試驗組間差異不顯著(P＞0.05)。
D1～D4處理見表2注。
圖2中草藥添加劑對克氏原螯蝦感染白斑綜合征病毒后成活率的影響
3討論
中草藥具有天然、高效、毒副作用少、資源豐富等優點，含有多種生物活性物質和天然營養物質，例如多糖、生物堿、蒽醌類、黃酮類化合物和葡萄糖氨基酸等，能促進動物的機體代謝和蛋白質以及酶的合成，提高營養物質的利用率，提高免疫力、成活率并促進養殖動物的生長。已有研究結果表明復方中草藥制劑對魚類和對蝦具有促生長作用，王蕓等報道，將大黃、黃芩、甘草和黃芪等比例組成的復方制劑投喂凡納濱對蝦后，其增質量率顯著高于對照組；丁賢等報道由板藍根、大葉青、黃芪等組成的復方中草藥可以顯著提高蝦腸道消化酶的活性，從而利于養分的消化，促進生長。本研究結果亦表明:由大黃、淫羊藿、黃芪和板藍根等組成的復方制劑，可以明顯促進克氏原螯蝦的生長，這與上述報道結果類似。推測其機理可能是，一方面，黃芪、淫羊藿、黃芪和板藍根含有黃酮類化合物、黃芪多糖、葡萄糖氨基酸以及鐵、鋅、硒等微量元素，這些都是動物生長代謝所必需的營養成分；另一方面，大黃、淫羊藿、黃芪等可以通過調節對蝦腸道消化酶和腸道菌群的組成而促進對飼料中營養成分的消化和吸收。但是大黃單一添加以及大黃與淫羊藿的配伍組合并未顯著提高克氏原螯蝦的增質量率，這與Xie等、Zhang等、Liu等的研究結果不一致，這可能是由于他們在試驗中所用的是中草藥提取物及其添加量不同導致的，具體原因還有待進一步的研究。
水產動物血液與機體的代謝、營養狀況以及疾病等有著密切的關系，當其受到外界因子的影響而發生生理變化時，必然會在血清指標中反映出來。因此，血清成分的變化被廣泛地用來評價水產動物的營養狀況和健康狀況，是重要的生理生化指標。血清中蛋白質含量反應了機體的營養和代謝狀況，Ming等在研究中指出，飼料中添加大黃能顯著提高團頭魴血清中總蛋白質含量；陸鑫等指出，復方中草藥能顯著提高尖吻鱸血清總蛋白質含量；王吉橋等也有類似研究。本試驗中，在基礎飼料中添加中草藥添加劑未能顯著提高血清總蛋白質含量，但白蛋白和銅藍蛋白的水平均顯著提高。本試驗還發現，中草藥添加劑的使用能顯著降低血清甘油三酯含量，這與明建華等關于大黃的研究結果是一致的。
另一方面，克氏原螯蝦等甲殼動物自身的防御機能主要依賴于自身的非特異性免疫系統，它包括天然形成或誘導產生的各種因子，以及各種具有免疫活性的酶類。酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶以及過氧化物酶等是生物體中重要的酶類，參與多種生理代謝反應，在異己物質的識別和免疫防御方面起重要作用，因此被作為健康評價的指標。其中超氧化物歧化酶是機體快速有效清除活性氧的重要抗氧化酶，是生物體防御氧化損傷的重要酶類，并被證明在多種十足類甲殼動物中具有免疫調節作用；此外，溶菌酶作為非特異性免疫的第一道屏障，有抗感染、增強抗生素效力、抗腫瘤和抗病毒等作用。中草藥中一些成分如多糖類化合物、免疫多糖等具有提高蝦類免疫功能的作用。本研究結果表明，在飼料中添加由大黃、淫羊藿、黃芪和板藍根組成的中草藥飼料添加劑，克氏原螯蝦血清中的超氧化物歧化酶和溶菌酶活性顯著增高，可以認為本試驗中所用復合中草藥添加劑可以通過提高水產動物血液中超氧化物歧化酶活性，減少自由基對于正常細胞的損傷；同時中草藥中的多糖及苷類化合物激活機體的溶菌酶活性。張耀武等采用黃芩、茯苓、板藍根、黃芪、大黃、甘草等7余味中草藥制成復方添加劑，按照一定比例添加于基礎飼料中并投喂羅氏沼蝦，結果表明羅氏沼蝦血清溶菌酶活力顯著提高，說明中草藥添加劑可以提高羅氏沼蝦的非特異性免疫機能。這也與Qiao等、王蕓等、Yin等和Jian等有關復合中草藥添加劑對凡納濱對蝦、羅非魚和建鯉機體超氧化物歧化酶、溶菌酶影響的研究結果是基本一致的。
本試驗中，克氏原螯蝦經注射WSSV后，中草藥添加劑組克氏原螯蝦的成活率顯著高于對照組(P＜0.05)，4種中草藥復合添加劑組效果尤其明顯，這可能是由于本研究中大黃、淫羊藿、黃芪和板藍根這4種中草藥的組合，一是很好地利用了大黃與黃芪的“相使關系”；二是大黃、淫羊藿和黃芪皆具有調節免疫和抗炎活性，可雙向調節免疫應答、炎癥反應過程中各種因子的產生；三是以黃芪補中益氣，淫羊藿調節免疫以扶，板藍根清熱解毒以祛邪，三藥合用，共奏扶正祛邪、清熱解毒之功。這與以前的一些研究報道是一致的，如Ardo等在飼料中添加黃芪和金銀花提取物可降低試驗魚攻毒后的死亡率，增強機體的抗病力；溫周瑞等也有類似報道。此外，Yin等也指出復合中草藥添加劑對鯉魚的抗菌效果比單一中草藥添加劑要好，說明藥物之間具有協同作用。
綜上所述，在基礎日糧中添加中草藥復合添加劑(0．3%大黃+0．3%淫羊藿+0．2%黃芪+0．2%板藍根)可以促進克氏原螯蝦的生長，提高機體的非特異性免疫力以及抵抗白斑病綜合征病毒的能力。