摘要
以花生粕作為魚粉蛋白替代原料，配制6種等氮等脂的南美白對蝦試驗飼料，其中花生粕的添加水平分別為0、70、140、210、280和350g/kg。每天投喂三次，養殖6周。結果表明，花生粕的添加水平達到140g/kg以上時，飼料效率和蛋白質效率顯著低于基礎飼料組（D1）（P＜0.05）。花生粕水平增加至210g/kg以上時，對蝦的存活率和蛋白酶活性顯著低于D1組；全蝦水分含量顯著增加（P＜0.05）。花生粕在飼料中添加水平達到280g/kg或更高時，南美白對蝦的增重率顯著降低（P＜0.05）。血清中過氧化物酶、酸性和堿性磷酸酶隨著花生粕添加水平的增加而降低，當添加水平達到280g/kg時顯著低于D1組（P＜0.05）。花生粕水平達到350g/kg時，對蝦的攝食率顯著低于D1組（P＜0.05）。隨著花生粕替代魚粉比例的增加，干物質、粗蛋白、粗脂肪和灰分的表觀消化率逐漸降低，但對南美白對蝦肌肉中的黃曲霉毒素含量沒有明顯影響。結果顯示，南美白對蝦飼料中花生粕的最大添加量為140g/kg。
1.前言
南美白對蝦，學名凡納濱對蝦，其生長快，抗病力強，適應性廣，十分適合密集養殖（Williams，Davis&Arnold，1996），在多個國家養殖。南美白對蝦已成為中國最主要的養殖蝦類，2007年其養殖產量達到106.57萬噸（Wu，2008）。魚粉因其蛋白含量高，氨基酸平衡性好，一直是南美白對蝦飼料首選的蛋白原料，目前國內對蝦商用飼料中魚粉的使用量一般在25%~50%（Amaya，Davis&Rouse，2007）。國際國內魚粉供給偏緊，價格長期居高不下，導致飼料成本持續增加（Davis等，2004）。為了減少南美白對蝦養殖對魚粉的嚴重依賴，人們將目光轉向廉價、來源廣的植物性蛋白原料的開發利用（Suarez等，2009；Ye等，2011）。然而，長期以來，國內外對花生粕作為水產蛋白原料利用的相關研究報道較少。
和豆粕相比，花生粕的蛋白質組成中賴氨酸含量偏低，精氨酸含量高些，蛋白品質略低于豆粕（Batal,Dale&Cafe，2005）。花生粕的粗蛋白含量高達40.1%~50.9%，可用于水產飼料中。全球花生的產量每年都在增加，近年來達到了3500萬噸。僅中國，花生的產量就為1200萬噸，占全球花生總產量的34%。因此，每年可產生350萬噸花生粕（Revoredo&Fletcher，2002）。花生粕作為替代蛋白源的研究在禽類和家畜中已有相關報道，在南美白對蝦中也有類似的研究報道。（Costa等，2001；Adeola，2009；Lim，1997；Liu等，2008）。為了深入了解南美白對蝦利用花生粕的潛力，本文研究了不同花生粕替代魚粉比例對南美白對蝦生長性能、飼料利用、消化酶活性、血液生化指標和蝦體黃曲霉毒素B1殘留的影響。
2.材料和方法
2.1試驗飼料
基于市售南美白對蝦商品料（RD）和常用的植物性、動物性蛋白源的營養成分和氨基酸組成（表1），配制6種花生粕添加水平的等氮（粗蛋白41%）等脂（粗脂肪8.5%）的試驗飼料（D1、D2、D3、D4、D5、D6），在基礎飼料（D1）中分別添加0、70、140、210、280和350g/kg花生粕代替魚粉蛋白。每種試驗料中加入0.5%Cr2O3，用于飼料消化率的測定。飼料原料用粉碎機進行粉碎，98%以上過80目篩網，飼料原料按飼料配方配制，混勻，加液體（魚油、豆油、卵磷脂和水）制成糊狀物，再用實驗用雙螺桿制粒機（CD4XITS）制成1.5mm的硬顆粒飼料，50℃下烘干，于-20℃冰箱保存，備用。試驗飼料配方及營養成分見表2，試驗飼料必需氨基酸組成見表3。
2.2生長和消化率試驗
南美白對蝦SPF蝦苗購于福建廈門漳浦前亭國家級南美白對蝦良種基地，試驗蝦苗于2個高為0.85米，上部直徑為1.22米，下部直徑為1.04米的圓形玻璃鋼水族箱中（水產養殖封閉循環系統，新奧爾良，洛杉磯，美國）暫養2周。在暫養期間，飼喂商業蝦飼料（RD）。試驗用蝦苗的初始體重為3.37±0.13g（平均值±SD），隨機分配到21個150L的循環流水過濾水族箱中，每箱放35尾蝦，3箱為一個試驗組，共7個試驗組，水溫維持在27±0.5℃。
每天分別在7:00、13:00和19:00投喂飼料，每次達到表觀飽食，投喂1h后回收未食完飼料，并根據剩余飼料量調整投喂量。消化試驗結合飼養試驗同時進行，飼喂對蝦7d后開始收集糞便。為減少糞便中營養的流失，每次在回收未食完飼料1h后用虹吸法只收集包膜完整的新鮮糞便，放入稱量瓶中，70℃烘干，直到糞便樣品夠試驗分析為止，糞便樣品保存在-20℃冰箱中待分析。為了更精確的評估攝食量，根據Cruz-SuaŁrez等人（2001）所描述的方法并稍加修改測試飼料浸出率，5g顆粒飼料放入80目篩藍中，浸入海水中連續曝氣60分鐘。在浸泡期間，每10分鐘輕輕攪拌一次飼料。剩余未溶解的飼料進行回收，在70℃下干燥并稱重。浸出試驗重復3次。
使用多參數光度計（HI83200，哈納儀器，索基特，RI，USA）測定水質，每天測量水體中溶氧，每周監測鹽度、pH值、銨態氮和亞硝酸鹽氮兩次。在飼養試驗期間，這些參數值分別介于6.0~7.5mg/L，26~30g/L，7.8~8.5，0~0.3mg/L和0~0.1mg/L。所有測量的水質指標均在正常范圍內。
2.3樣品采集
試驗結束后，南美白對蝦禁食24h后，分別稱每箱蝦總重，記錄蝦數。從每箱隨機取10尾蝦，合并稱重，絞碎，于70℃烘箱中烘干，粉碎后全蝦樣品稱重，裝入密封袋中于-20℃冰箱中保存，用于常規成分分析。另從每箱隨機取10尾蝦，用1mL無菌注射器經預冷抗凝劑潤濕后，逐尾從心臟采血。采集的血液按箱合并，放入滅菌離心管中混勻，3000r/min4℃下離心20min，收集血清，保存于-80℃冰箱用于分析血液生化參數。采完血后，將蝦解剖，取出肝胰腺、胃和肌肉，分別按箱合并，腸腺和胃在-80℃下保存，用于測定消化酶活性；肌肉儲存于-20℃，用于測定黃曲霉毒素B1。
2.4生長性能和消化率的計算
按下式計算增重率（WG）、飼料系數（FCR）、蛋白質效率（PER）、攝食率（FR）和成活率（SR）。
WG=100×(Wf-Wi)/Wi
FCR=Wc/(Wf-Wi)
PER=100×(Wf-Wi)/(Wc×P)
FR=100×Wc/[(Wi+Wf)/2]/t
SR=100×Nf/Ni
式中：Wi(g)為平均每尾蝦初始體重；
Wf(g)為平均每尾蝦終末體重；
Wc(g)為平均每尾蝦攝食飼料總量（風干樣重）；
t(d)為飼喂天數；
P(g)為平均每尾蝦攝入蛋白質總量；
Ni為初始蝦尾數；
Nf為終末蝦尾數。
試驗飼料營養成分(干物質、粗蛋白、粗脂肪和灰分)的表觀消化率（ADC）計算公式如下（DeSilva&Anderson，1995）：
ADC(%)=100+100×(F)/(D)×(DCr)/(FCr)
式中：F為糞便中某營養成分的百分含量，D為飼料中某營養成分的百分含量，DCr為飼料中Cr2O3百分含量，FCr為糞便中Cr2O3百分含量。
2.5化學分析
飼料原料、飼料、糞便樣品和蝦樣品的常規營養成分分析：樣品中粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分含量根據AOAC1995測定。粗蛋白采用凱氏定氮法(N×6.25)；粗脂肪含量測定采用索氏抽提法；水分含量測定采用105℃常壓烘箱干燥恒重法；灰分含量測定采用馬福爐550℃灼燒法；Cr2O3含量測定采用原子吸收法（美國熱電SolaarM6型原子吸收光譜儀）；氨基酸含量測定采鹽酸水解法，利用日立L-8900氨基酸自動分析儀進行分析。
黃曲霉毒素B1采用酶聯免疫吸附試驗（Lee，Wang，Allan&Kennedy，2004）。將飼料和肌肉樣品磨成粉，玻璃燒瓶中加入5g樣品與75mL80%的甲醇溶液（體積/體積）混合，在旋轉搖床上120rpm搖15min，溶液靜置30分鐘后取上清液用于黃曲霉毒素B1的分析。
2.6蛋白酶活力和血液生化指標測定
肝胰腺、胃按質量體積比(W/V，1/10)分別加入pH7.5預冷10mmol/L的Tris-HCl緩沖液，用高速組織勻漿機在冰浴中勻漿，勻漿液以10000r/min，4℃離心20min，取上清液用于測定總蛋白酶活力。蛋白酶活力測定采用Yu等(2008)方法并加以改進。取0.2mL上清酶液與2mL5g/L的酪蛋白、0.1ml40mM/LEDTA-Na2、0.4mL緩沖液、0.8mL蒸餾水37℃孵育15min后，加入1mL30％（V/V）預冷的三氯乙酸以終止顯色反應，3000g離心20min，取上清液1mL加入0.55mol/L的碳酸鈉溶液5mL，福林試劑1mL于37℃水浴鍋中顯色15min，在波長680nm處測定其光密度值，同時用標準L-酪氨酸作標準曲線。蛋白酶活性單位定義為：在一定pH和溫度(37±1℃)下，1g消化部位鮮活組織內蛋白酶1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸，即為1個蛋白酶活力單位（U）。
2.7血液生化指標測定
血清溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和酸性、堿性磷酸酶(ACP、AKP)用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定，具體操作按照試劑盒說明書要求進行。溶菌酶活以溶壁微球菌(0.2mg/mL)(Sigma,StLouis,MO,USA)(Ellis，1990)凍干粉為底物。溶菌酶活力單位(µg/mL)定義為：37°C時每分鐘OD530下降0.001為一個活力單位。超氧化物歧化酶采用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶化學發光法測定，底物與2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基酚)-5-苯基氯化四氮唑反應生成紅色甲月替染料(McCord & Fridovich，1969)。超氧化物歧化酶酶活單位(U/mL)定義為：在550nm處，抑制NBT光還原相對百分率為50%時的酶量。過氧化物酶采用H2O2減少的方法測定(Brokken，Verbost，Atsma & Wendelaar Bonga，1998)，過氧化物酶酶活單位(U/mL)定義：在37℃過氧化氫存在的條件下，每分鐘將鄰甲氧基苯酚氧化成1μg紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚所需的酶量。ACP和AKP采用Zhao，Liang和Zhang(2010)的方法，即將血清與2%(w/v)硝基苯磷酸鹽37℃分別在酸性(pH5.5)或堿性(pH10.1)緩沖液中孵育30min，測定520nm處的吸光值，酶活單位(U/100mL)定義為：在37°C反應30min每100mL血清產生1mg硝基酚酯所需的酶量。
2.8數據分析
所有實驗數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS13.0進行單因素方差分析(ANOVA)差異的顯著性，并進行Student-Neuman-Keuls多重比較。增重率、飼料系數、蛋白質效率、攝食率、存活率、全魚組成和消化率數據用百分比或比率表示，并在統計分析前進行反正弦變換。不同組間的差異顯著性用P<0.05表示。
3結果
3.1生長指標
飼料中花生粕替代魚粉比例對南美白對蝦生長性能的影響結果見表4。隨著飼料中花生粕添加水平的增加，增重率、蛋白質效率、攝食率和蝦存活率均降低，當添加水平為280～350g/kg時，白蝦的增重率較對照組顯著降低，添加水平為70g/kg組白蝦的蛋白質效率與對照組相近，但是顯著高于140～350g/kg組和參考飼料組。添加水平為70～280g/kg時，白蝦攝食率與對照組相近，添加水平為350g/kg攝食率最低。添加水平為70～140g/kg時，白蝦的存活率與對照組和商品飼料組沒有差異，但是比其他處理組高。飼料系數隨飼料中花生粕添加比例的增加而逐漸升高，當添加水平增至140～350g/kg時，飼料系數顯著增加。當白蝦飼料中花生粕添加水平為0和70g/kg時與商品飼料組相比，飼料系數更低，蛋白質效率更高。
3.2南美白對蝦體成分及肌肉中黃曲霉毒素B1殘留水平
飼料中添加不同水平的花生粕對南美白對蝦體成分及飼料中黃曲霉毒素B1在肌肉中殘留的影響見表5。隨著花生粕添加水平的增加，蝦體粗蛋白和灰分含量逐漸降低，蝦體水分逐漸增加。當花生粕添加水平增至280~350g/kg時，與0添加水平相比，蝦體粗蛋白含量顯著降低，蝦體水分含量則顯著增加。與0添加水平相比，350g/kg組蝦體粗灰分含量顯著降低。各組間蝦體粗脂肪含量和肌肉中黃曲霉素B1水平差異不顯著。
3.3表觀消化率
南美白對蝦對飼料干物質、粗蛋白、粗脂肪和灰分的表觀消化率結果見表6。隨著花生粕替代魚粉蛋白比例的增加，干物質、粗蛋白、粗脂肪和灰分的表觀消化率逐漸降低。各試驗組的干物質和粗蛋白的表觀消化率顯著低于對照組；花生粕添加水平在140~350g/kg時，各組粗脂肪和灰分的表觀消化率顯著低于0和70g/kg組。
3.4蛋白酶活力
結果見圖1。各試驗組的肝胰腺和胃蛋白酶活性均低于對照組，當花生粕添加水平為70~140g/kg時，肝胰腺和胃蛋白酶活與基礎飼料組和商品飼料組相近，當添加水平為210~350g/kg時，肝胰腺和胃蛋白酶活性顯著降低。
3.5血液指標
血液中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）酶活變化趨勢與增重率和蛋白質效率相似，見表7。除超氧化物歧化酶外，當花生粕添加水平為210~350g/kg時，白蝦血液參數較對照組顯著降低。各處理組白蝦血液中溶菌酶活性差異不顯著。
4討論
本研究在實驗室條件下探討了實用配方添加花生粕的可行性。本試驗結果表明隨著花生粕添加水平的增加，增重率、飼料效率、蛋白效率和白蝦的存活率呈下降趨勢，此外，不同花生粕添加水平組的生長性能也不同。對白蝦增重率、飼料效率、蛋白效率和蝦存活率無負作用的花生粕添加水平上限值分別為210、70、70和140g/kg。Lim(1997)和Liu等(2008)研究表明，在飼料中添加較低水平的花生粕（104~120g/kg）對白蝦的生長性能無不良影響。這些結果表明白蝦對花生粕替代魚粉的比例是有限的。
隨著花生粕替代魚粉蛋白比例的增加，南美白對蝦的胃蛋白酶活性逐漸降低，肝胰蛋白酶活性先增高后降低，并且營養物質消化率也隨花生粕替代魚粉比例增加而降低(Klein，Cohn&Alpers，1998)，提示大幅度增加花生粕替代魚粉比例會降低南美白對蝦消化力，影響營養物質消化，進而影響南美白對蝦的生長性能。與花生粕相似，在魚飼料中添加過高的豆粕也會降低消化酶活性(Bureau，Harris&Cho1998;Krogdahl等，2003;Krogdahl&Bakke-McKellep，2005)。花生粕明顯影響了營養消化率，對于干物質和粗蛋白的表觀消化率的負面影響大于粗脂肪和灰分。魚飼料中添加高水平的植物蛋白也有相似的結果(Opstvedta等，2003;Tomás等，2005)。因此，營養物質表觀消化率的降低，特別是蛋白質，是造成白蝦飼喂花生粕后生長性能下降最有可能的主要原因。另外，花生粕大量添加時，飼料中蛋氨酸+胱氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸含量降低，破壞了飼料中氨基酸平衡性，降低了白蝦的生長性能和飼料利用率。
盡管各試驗組飼料的粗蛋白水平相近，但是各組的白蝦蛋白質效率卻明顯不同，結果表明花生粕影響飼料中蛋白的利用率，低品質的飼料蛋白會降低蛋白利用率(Day&Plascencia-GonzaŁlez，2000)，由此可能導致魚體內蛋白質的降解。在虹鱒的研究中既證實了這一現象。虹鱒飼喂低品質蛋白的飼料會導致體內蛋白質的降解。(Martin等，2003)。由于賴氨酸和精氨酸在消化、吸收過程中能產生拮抗(Kim,Kayes&Amundson，1992；Berge,Bakke-McKellep&Lied，1999)，精氨酸的增加會降低賴氨酸的消化率(Fournier等，2003)。因此蛋白飼料的生物效能可能部分依賴于賴氨酸和精氨酸在消化吸收中相互拮抗的作用。(Goytortua-Bores等，2006)。在本研究中，當飼料中花生粕添加量為140~350g/kg時，飼料中精氨酸的含量比對照組高13.6~32.2%。因此我們認為飼喂花生粕飼料時可能會出現賴氨酸和精氨酸的拮抗作用，從而影響了賴氨酸的吸收利用。因此我們推測，花生粕大量添加時，過高的精氨酸含量降低了南美白對蝦對蛋白的利用率。
在某些情況下，飼料中高含量的植物蛋白成分可降低水產動物的適口性(Lim&Dominy，1990)。在本研究中，花生粕添加過量，當添加水平達到280g/kg時降低了白蝦的攝食率。精氨酸和誘食劑可以增強魚類和甲殼動物的食欲(Borquez&Cerqueira，1998;Goytortua-Bores等，2006)，盡管花生粕添加量為350g/kg時，精氨酸含量很高，但在飼料中添加誘食劑也無法逆轉該組攝食率下降的結果。
本研究發現，當白蝦飼料中花生粕含量達到280g/kg或更高時，將降低對蝦的體蛋白和體灰分的沉積，而體水分含量增加，綜合前人的研究提示，體水分沉積的增加可能導致了體蛋白和體灰分的消耗（Lim，1997）。體蛋白和體灰分沉積降低的原因有可能是南美白對蝦消化力下降影響了營養物質的消化吸收，然而對蝦體脂肪沉積沒有受影響的機制仍不清楚。
本研究結果發現，除溶菌酶外，飼料中用花生粕替代魚粉蛋白明顯降低血清超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和酸性、堿性磷酸酶（ACP、AKP）活性，且花生粕添加比例愈大，降低作用愈明顯，特別是當添加水平高于210g/kg時，飼料中添加高水平的花生粕可能會使對蝦營養不良和處于高度物理應激狀態，進一步表現為降低生長性能。在用其它植物蛋白源替代魚粉時，魚、蝦也出現類似現象(Rumsey等，1994;Burrells等，1999;Krogdahl等，2003;Tibaldi等，2006)，這可能與植物蛋白原料大比例替代魚粉導致水產動物營養不良有關。本研究發現，飼料中添加不同水平的花生粕對血清中的溶菌酶活性無影響，與Sitja-Bobadilla等(2005)的研究一致，豆粕對吉富羅非魚(Sparusaurata)的溶菌酶活性也沒有影響。
由于花生粕易感染黃曲霉菌，限制了其在配合飼料中的應用。本研究測定了花生粕替代飼料中黃曲霉毒素含量以及蝦肌肉中黃曲霉毒素殘留量，發現飼料中黃曲霉毒素的含量隨著花生粕添加比例的增加而增加，但是試驗組飼料中最高的黃曲霉毒素含量也低于10µg/kg，最高值也在歐盟、日本、加拿大、澳大利亞、美國等多個國家的人類食品安全限制的范圍內（5~20µg/kg）(FAO2004)。蝦肌肉中的黃曲霉毒素不受飼料中黃曲霉毒素含量的影響，在飼喂6周后仍保持在較低水平（低于5µg/kg），說明黃曲霉毒素在蝦肌肉中的殘留量相對較低。Boonyaratpalin等(2001)也觀察到類似現象，在飼喂4~6周后斑節對蝦肌肉中的黃曲霉毒素殘留量與飼料中的含量沒有相關性。Deng等(2010)研究發現在羅非魚飼料中添加不同劑量的黃曲霉毒素飼喂20周后，僅在肝胰臟中有殘留，而不是在肌肉中。這些結果表明黃曲霉毒素在魚、蝦體內的消除可能存在時間效應關系，需要進一步的研究來證實。
5小結
飼料中花生粕較大比例替代魚粉時，南美白對蝦的生長性能、飼料效率、營養物質消化率以及抗生理應激能力明顯降低。飼料中高水平添加花生粕對對蝦的不良反應可能是由于飼料中缺少某些必需氨基酸和營養物質消化率低而造成。在本試驗條件下，南美白對蝦飼料中花生粕的最大用量為140g/kg。此劑量的花生粕在飼喂白蝦6周后，肌肉中黃曲霉毒素B1含量仍然很低，在飼料中應用能夠滿足食品安全的需求。（完）
（原文：Xiang-heLiu,Ji-danYe,KunWang,Jiang-hongKong,WeiYang&LeiZhou.PartialreplacementoffishmealwithpeanutmealinpracticaldietsforthePacificwhiteshrimp,Litopenaeusvannamei[J].AquacultureResearch,2012,43,745–755）
1、來源：《中大水生通訊》第52期
2、作者：廣州市誠一水產科技有限公司郭定乾/譯
3、廣州市誠一水產科技有限公司微信號：gzchengyi2013