Velmurugan Karthikeyan 印度 2015年
摘要：南美白對蝦是養殖最廣泛的蝦品種，跟其它蝦一樣都容易感染微生物繼而發病。在本研究中，真菌泡盛曲霉KM434331引起了南美白對蝦的黑鰓，這是首次在印度的泰米爾納德邦，納格伯蒂訥姆地區的Vellapallam的南美白對蝦養成池塘中發現并報道。從病蝦的鰓部分離出了泡盛曲霉 KM434331。此外，鑒定了它的形態、培養和系統發育特征。組織病理顯示，它發生了炎癥反應，出現了溶血性滲透、包被作用、黑化作用，膠原樣纖維沉積在蝦的鰓部。除此之外，泡盛曲霉KM434331引起鰓的功能性障礙，導致養成池塘蝦的慢性死亡。
1、前言
水產養殖是全球全球重要的經濟活動（Kathiresan等，2012），為全球提供了三分之一的食物（聯合國糧農組織，2009年）。南美白對蝦是重要的經濟養殖對蝦之一，目前許多國家都在養殖它，尤其是在東南亞（Alcivar-Warren等，2007）。在南美白對蝦的育苗和生產的過程中嚴格控制特定病原，以保證南美白對蝦產業的正常進行。然而，目前貝類和有鰭魚的養殖正在經受真菌感染的困擾(Khoa et al., 2005)。1969年Hubschman報道，shrimp Palaemonetes kadiakensis的幼體原發感染過水霉。黑鰓病首次是在美國龍蝦上報道的(Lightner and Fontaine, 1975)。一般來說，黑鰓是由鐮刀均屬引起的，開始是鰓發生變色，而后才發展成黑鰓，最終導致感染物種的死亡(Khoa, 2005)。有報道表明，串珠鐮刀菌在日本對蝦的早期階段，導致它鰓部的顏色略有變化，從不透明的白色變為有黑色的斑點。此外，串珠鐮刀菌分生孢子經過肌肉接種，證明它可以引起蝦黑鰓并導致蝦死亡(Rhoobunjongde et al., 1991)。口蝦蛄在實驗室感染真菌和那些自然感染蝦的病癥相似。組織病理學研究表明，在鰓絲里面發現菌絲和分生孢子，在鰓絲和鰓基礎結構上，菌絲和分生孢子被血細胞包圍。結果證實，兩種無性型真菌Plectosporium oratosquillae 和頂枝孢屬是口蝦蛄的致病菌(Duc et al., 2009)。然而，至今沒有泡盛曲霉KM434331真菌感染南美白對蝦導致黑鰓的報道。所以本研究首次報道了，從南美白對蝦的黑鰓部位分離出了泡盛曲霉 KM434331。研究表明，泡盛曲霉KM434331是在半咸水的成蝦養殖池塘中感染南美白對蝦的鰓部。
2、材料和方法
2.2 樣品采集
從2013年5月到2014年4月，通過拋網取黑鰓的12-16g南美白對蝦。采集到30-45尾感染的蝦，并對每尾蝦帶回實驗室進行進一步研究。
2.3組織病理學研究
對瀕死的感染真菌的蝦的肝臟和肌肉注射戴維森固定液，防止其自溶。注射后，將整尾蝦浸泡在戴維森固定液中48小時，之后再進行處理。將黑鰓的部分剪下，浸泡在戴維森固定液中48小時，之后轉移至70％乙醇作進一步處理。此外，切面用蘇木精和伊紅染色，在40×的光學顯微鏡下觀察切片，進行常規病理研究。
2.4 微生物學研究
黑鰓組織是從感染真菌的鰓部剪下來的，在40×的光學顯微鏡下觀察。黑鰓組織用無菌生理鹽水（0.85％NaCl）清洗3次，之后進行細菌分離，接種到沙氏葡萄糖瓊脂平板上，并用兩性霉素B和硫酸鏈霉素來抑制其它菌的污染。此外，將平板在25℃培養4天，之后25℃SDA斜面純種擴增培養用于隨后的實驗。真菌菌株通過LPCB鑒定，形態通過光學顯微鏡觀察。
2.5 掃描電鏡（SEM）
2.6 分子鑒定和系統發育分析
3 結果
3.1 顯微和組織病理學觀察
南美白對蝦黑鰓的外部臨床癥狀就是鰓的外部顯現呈黑色。圖1為光鏡下觀察南美白對蝦正常的鰓和感染蝦蝦鰓的真菌分生孢子被包被在鰓小葉中。圖2 為組織學結果，有正常和病變蝦鰓，病變蝦鰓的血腔橫切面顯示，鰓小片里面包被了菌絲。且溶血性滲透使得大量物質外滲，導致凝固性壞死。
圖1 （A）光鏡下正常鰓（B）光鏡下感染真菌蝦的鰓外觀
圖2 （A）正常鰓小片（B）鰓組織血腔橫切面，血細胞由大量凝固性壞死物質包圍。
3.2 微生物學研究
SDA平板上的菌落顏色開始是灰色的，之后迅速變為明亮的淺綠色。分生孢子的梗粗糙起來，長至1mm長，呈松散輻射、獨立和柱狀分布。二層的，有些分生孢子頭直接連接著瓶梗，里面有囊泡。瓶梗7-10×2-2.5微米;分生孢子通常呈球形或亞球形，偶爾橢圓形，明顯粗糙，直徑3-6微米，但大多小于4-5 微米的直徑（圖3）。
圖3 （A）LPCB觀察山泡盛曲霉KM434331成熟的分生孢子梗的顯微照片。（B）LPCB觀察顯示分生孢子、分生孢子梗和泡盛曲霉KM434331。
3.3 掃描電鏡
掃描電鏡觀察到了許多菌絲，泡盛曲霉KM434331菌落有分生孢子梗和分生孢子
頭。分生孢子頭通常呈輻射狀，分裂成幾個規則的列，偶爾柱狀頭，分生孢子為球形或
亞球形。其表面覆蓋了大量的分生孢子和泡盛曲霉KM434331孢子（圖4）
圖4 （A）許多菌絲、成熟的分生孢子和泡盛曲霉KM434331的分生孢子梗的顯微照片。（B）分生孢子覆蓋整個分生孢子梗的表面。（C）盛曲霉KM434331孢子的照片。（D）電鏡近距離觀察盛曲霉KM434331孢子的照片。
3.4 系統發育分析
真菌泡盛曲霉通過進一步的18S rDNA檢測和BLAST同源性分析，結果表明：分離出的casvk5（KM434331）與泡盛曲霉EU821242的相似度極高，為100%。此外，系統進化樹分析表明，分離的單系群間分支的差異極小（圖5 ）同時，進化樹表明A. brasiliensis和A. usamii的親緣關系較近。
圖5 系統進化樹顯示，泡盛曲霉CASVK5 KM434331和其它曲霉屬真菌的親緣關系。
4 討論
現代集約化水產養殖導致真菌病的感染在全世界的水產養殖業中大量暴發(Karthikeyan and Gopalakrishnan,2014)。本研究首次報道了，泡盛曲霉導致了南美白對蝦成蝦養殖池塘蝦的黑鰓。目前對泡盛曲霉KM434331的分離和鑒別主要是通過形態學、系統發育、掃描電鏡 和組織病理分析。泡盛曲霉是最普遍存在的種類，從蝦分離的各種泡盛曲霉可占分離出來真菌的22% (Silva et al., 2011)。曲霉屬廣為人知，是因為它產生的黃曲霉毒素有致癌的可能(Lacaz et al., 2002)。霉菌病是羅非魚的主要疾病(Olufemi, 1983)。推測這些真菌的感染是通過魚飼料的污染傳染的(Saleem et al., 2012)。腐皮鐮刀菌造成網箱養殖龍蝦的黑鰓，并且嘗試恢復97只感染真菌之后黑鰓的龍蝦(Nha et al., 2009)。然而，在日本對蝦的黑鰓病變處分離出了串珠鐮刀菌(Rhoobunjongde et al., 1991)。2009年Duc報道，口蝦蛄的鰓部感染了枝頂孢屬和P. oratosquilla兩種變形的真菌。雖然，曲霉屬被認為是魚和蝦的病原體，但還沒有報道過它導致了蝦的黑鰓。因此，這是第一次報道，從蝦黑鰓的位置分離出了泡盛曲霉KM434331 。
在本研究中，組織病理學表明，泡盛曲霉KM434331產生的致癌毒素，導致鰓部出現黑斑病灶。鰓部血細胞的被包被作用對蝦的呼吸系統造成損傷，黑化作用將最終導致蝦的死亡。然而，這個病理癥狀同另一個報道的真菌疾病很相似。里爾的Fe 2+離子吸收反應導致了黑斑病變(Brain and Egusa, 1981)。
SEM表明，泡盛曲霉KM434331菌落包含分生孢子梗、分生孢子頭，分生孢子呈球形或亞球形，覆蓋整個分生孢子梗表面。這同致病菌泡盛曲霉 BTMFW032相似（Beena et al., 2010）。系統進化樹的結果表明，它與以前的泡盛曲霉的相似度為100%i(Basheeretal.,2011)。
5 結論
本研究可能是病原菌泡盛曲霉在南美白對蝦養殖上的第一份報道。在南美白對蝦的養殖過程中，發育不良容易感染疾病。當環境不良，如水源污染、高密度養殖、投料過多時，會感染泡盛曲霉。因此，南美白對蝦養殖過程需要更規范、合理。盡管如此，本次調查對南美白對蝦養殖中蝦感染泡盛曲霉提供的詳細的信息。
譯者：利洋公司技術部 陳明衛