作者來自泰國
摘要：本文介紹了一個寄生于斑節對蝦肝胰腺的新型微孢子蟲種，對蝦腸孢子蟲。描述了這種寄生蟲的不同階段，從早期的孢原細胞到寄生于宿主細胞質中的成熟孢子。這種多核孢原細胞表面包含無數的小泡，直接存在于宿主的細胞質內，在早期發育過程中，孢原細胞的核進行二次分裂，在孢原細胞內形成無數的預成孢子。而電子致密環和極管前端是優先于在合孢體表面的早期孢子細胞萌芽在合孢體的細胞質中發育形成的。成熟的孢子呈橢圓形，測量為0.7*1.1μm，包含一個細胞核，5-6圈極絲，一個后位空泡，一個錨盤附在極絲上，和一個厚的電子致密壁，這個壁是由質膜構成的，一相對薄的電子透亮的孢子內壁（10nm）和電子致密的孢子外壁（2nm），DNA引物設計源于微孢子蟲的SSUrRNA基因，片段擴增為848bp（GenBank登錄號FJ496356），測序產物與拜氏微孢子蟲的SSUrRNA具有84％的同一性，即基于腸孢子蟲家族獨特的超微結構特征，合孢體的細胞質位置和SSUrRNA序列與拜氏微孢子蟲有16%不同，這種寄生蟲被定為一種新的物種，即對蝦腸孢子蟲，屬于腸上皮微孢子蟲屬。
【簡介】
自2003年起，泰國斑節對蝦的養殖一直受生長緩慢綜合征（MSGS）的影響，土池養殖中，受MSGS影響的蝦與未受影響的蝦相比生長率大幅度下降，損失堪比白斑病毒病（WSSV）。雖然通過組織病理學，透射電子顯微鏡（TEM），聚合酶鏈反應等方法可以在幾種器官中觀察到多種傳染性病原體，但是MSGS的病因尚未完全闡明。更為顯著的是，可以在淋巴器官中觀察到多個球狀體，表明包含了幾種已知或未知形態的病毒。病蝦的肝胰腺細胞中有時也可觀察到對蝦桿狀病毒（MBV），肝胰腺細小病毒（HPV）的包涵體，也可能是到目前為止沒有鑒定出的微孢子蟲。
微孢子蟲是一種可感染多種真核生物的專性細胞內寄生蟲，一般在宿主細胞中通過核擴散形成孢子來進行發育，而且某些屬在宿主細胞核質內進行相似的發育，也有報道稱微孢子蟲有些屬會感染甲殼動物，包括八孢蟲，微粒子蟲，小孢子蟲，匹里蟲，單極蟲，Flabelliforma，格留蟲,Vavraia,Ordospora,Nadelspora和Enterospora.據報導，各種甲殼動物的組織和器官已經被感染，例如：帕沙瑞帕斯和弗萊格爾報道對蝦八孢蟲感染南美白對蝦和斑節對蝦的肌肉和結締組織；燦寧等人報道單極蟲感染棕蝦和白蝦的肌肉。發病機制使蝦的整個肌肉和腹節發展為多發性病變，導致蝦出現“棉花尾”癥狀，對蝦的肌肉組織受微孢子蟲感染也見報道。
少數微孢子蟲只感染甲殼動物肝胰腺小管的上皮細胞，斯騰福德等人發表的刊物中描述了兩種歐洲蟹被微孢子蟲感染，這種微孢子蟲由于合孢體細胞核的位置被歸類到微孢子門的腸上皮細胞微孢子蟲科，同時也是基于孢子的擠壓結構先質的形成（如極絲、錨盤），還有這種寄生蟲的合孢子（即成為獨立成熟孢子之前）內形成的其它細胞器。這一發現是證明腸上皮細胞微孢子蟲在甲殼動物體內的另一個典型代表。
這種新型細胞質微孢子蟲只感染受生長緩慢綜合癥（MSGS）影響的的斑節對蝦的肝胰腺小管上皮細胞，發生率較高，正好提供了一個研究其發展和分類的機會。重點是對這種寄生蟲組織病理學和超微結構功能的研究，也包括對它SSUrRNA基因的一部分與數據庫中其它微孢子蟲的序列進行比較分析。
圖一、斑節對蝦肝胰腺小管的上皮細胞中的對蝦腸孢蟲顯微照片
（A）肝胰腺組織H＆E-染色涂片顯示出大量的微孢子蟲孢子（箭頭所示）。
（B）梯度分離液提取的微孢子蟲孢子。
（C和D）肝胰腺組織切片顯示肝胰腺小管上皮細胞質中的嗜酸性的粒狀包涵體（箭頭所示）。
（E）肝胰腺組織半薄切片顯示在小管上皮細胞質內早期和晚期的合孢體（插圖a）以及成熟孢子（插圖b），一些孢子沒有顯示出染色點代表他們凹面的一端。A，蘇木染色；C，三色染色；D，H＆E染色；E，甲苯胺藍染色。
ePM：合孢體早期；lPM：合孢體后期
圖二、對蝦腸孢蟲在斑節對蝦肝胰腺小管上皮細胞發育的早期階段透射電子顯微照片
（A）有兩個核的早期合孢體階段。
（B）多核的早期合孢體階段。
（C）在宿主細胞內一組合孢體被一個液泡包圍，表明出現了核分裂（插圖中箭頭所示）
MV：微絨毛；V：液泡
圖三、斑節對蝦肝胰腺小管上皮細胞中對蝦腸孢蟲孢原細胞階段的透射電子顯微照片
（A）早期含核的孢原細胞，清晰的囊泡（插圖a,箭頭所示）,極絲前型（插圖a,箭頭所示；插圖b）。
（B）孢原細胞邊緣位置的孢子原生質（星號所示）。
（C）孢原細胞外圍的幾個預成孢子（星號所示）。
（D）原生質膜呈現出微絨毛狀結構被宿主細胞質（箭頭所示）中大量的粗面內質網（箭頭所示）所包圍。
（E）合孢體加厚的質膜在與宿主細胞質的接口處顯示出囊狀結構。
（F）晚期孢原細胞顯示已發育好預成孢子、極絲和極帽。
【討論】
這是第一份關于微孢子蟲超微結構特征和完全感染斑節對蝦肝胰腺小管上皮細胞的部分SSUrRNA基因序列的報道，其獨特的結構特征與腸上皮微孢子蟲家族相關聯，基于它不同于微孢子蟲家族中Nucleospora屬和Enterospora屬，而相似于腸上皮細胞微孢子蟲屬的單一物種，所以我們把感染斑節對蝦的新型微孢子蟲歸類到腸上皮細胞微孢子蟲屬。我們認為它在無脊椎宿主上的發生率以及與拜氏微孢子蟲SSUrRNA序列的同一性相對較低都可以證明它是本屬中的一個新物種。
對蝦腸孢蟲這一新物種的命名只是基于符合腸上皮細胞微孢子蟲整個家族獨特特征的超微結構特點，而不是區別于這個家族的其它種類，例如拜氏微孢子蟲也是在宿主細胞的細胞質中發育，Enterospora屬和Nucleospora屬的一些種是在宿主細胞的細胞核內發育。區別出Enterospora屬和Nucleospora屬很明顯的是根據細胞核的發育而不是細胞質的發育，然而，區分出拜氏微孢子蟲并不是一開始那么清晰。
對蝦腸孢蟲與腸上皮細胞微孢子蟲屬唯一的成員——拜氏微孢子蟲有幾點相像之處，這兩個物種的孢原細胞都位于宿主細胞的細胞質中，并在孢子擠壓裝置和成孢子細胞萌芽形成之前形成初期形態；這兩個物種的孢子細胞都被釋放到宿主細胞的細胞質中接著直接發育成卵圓形的孢子。其它類似的形態特征包括每個孢子都含有后位空泡和5~7圈的極絲排成兩列。但是對蝦腸孢蟲的平均孢子大小（在新鮮制劑中1.1*0.7μm）比拜氏孢子蟲（1.5*0.5–1.0μm）小一點，兩個物種區別不是很大，有爭議說兩種生物不足以命名為兩個不同的物種。
因為被拜氏孢子蟲感染的脊椎動物中只有單核生物被報道，所以可以推測其它的生命周期階段，比如微孢子形式和配子，可能發生在一個交替寄主體內，蝦可以構成一個這樣的宿主。然而，實際上在斑節對蝦中的孢子也同樣是單核的，并且他們的發育更類似于拜氏孢子蟲，而不是反對這種可能性的從微孢子或減數分裂的核發育。此外，在人類傳染病中關于拜氏孢子蟲來源的研究認為可能與鳥類和哺乳動物的關系比蝦密切，并且是淡水源而不是海水。所有的信息更偏向于贊成對蝦腸孢蟲不同于拜氏孢子蟲的觀點。
兩者的rRNA基因小亞基片段之間存在16%的差別可以認為其不同于其他種屬的一個依據。一般來說在確定同種屬的時候，基因相似性要達到97%，因此基因相似性在84%的范圍的就會被認為是獨立的新種。事實上N.salmonis和拜氏孢子蟲在種屬上有著85%的差別，這可能表明對蝦微孢子蟲應該是寄生在斑節對蝦中的一個新的種屬。因此我們建議建立一個新的種類在腸上皮微孢子蟲屬而不是保守的認為其是一個新的屬。
在系統發育樹上來看，也許單個基因達到848bp沒有足夠目標基因的覆蓋比例而使組成的系統發育樹達不到足夠的數據量。盡管有這樣的警告，我們的微孢子蟲系統發育樹與其他數據庫之間的聯系是與以前出現的很多報道相似的。無論如何，我們完全基于本地區的初步分析表明，對蝦腸孢蟲與在其他水生動物宿主身上發現的微孢子蟲是相似的。這種有趣的關系可能隨著時間的推移而對更多的基因信息方面的研究有所幫助。
對于之前描述的來自于蟹寄主的腸上皮細胞微孢子蟲家族其他成員來說，對蝦腸孢蟲沒有可用的遺傳信息。然而，他們與對蝦腸孢蟲大大的不同是他們在宿主的細胞核內發育，而不在細胞質中。此外，對蝦腸孢蟲感染肝胰腺小管上皮細胞的所有形態的細胞除了F-細胞而Enterosporacanceri感染所有形態的細胞除了B-細胞。
唯一對泰國對蝦其它孢子蟲的描述就是對蝦八孢蟲，導致肌肉和結締組織感染，原生質中的核為四倍體，通過孢子生殖變成單倍體的核。此外，Apenaei與對蝦腸孢蟲SSUrRNA序列只有71％的相似度，顯然他們只是遠親。
微孢子蟲中的幾個種類能直接在宿主細胞細胞質中繁殖，而不在液泡中。然而腦炎微孢子蟲和格留蟲有一個寄生泡，在宿主細胞的細胞質中的早期感染階段起到防止被破壞的作用。發現對蝦腸孢蟲有些合孢體有液泡而有些則沒有。然而，這些小泡和類似微絨毛的結構存在于厚的膜內周圍是沒有液泡的合孢體，這可能是因為開始時合孢體在液泡中作為一個微小結構，直到合孢體膜擴展到一定區域與液泡膜直接接觸形成一個厚的雙膜結構。如果是這樣，由于缺乏完整的細胞膜，可能觀察到小泡和類似微絨毛的結構。類似一個薄的，無固定形態的電子致密層，也在感染褐蝦肌肉的微孢子蟲Vavraiamediterranica合孢體膜的外表面發現。不幸的是，沒有合適的rRNA基因序列適合這個物種。
在圍繞著對蝦腸孢蟲的宿主細胞質中發現豐富的粗面內質網和線粒體，但不在蟲體的細胞質內，這對于微孢子蟲是正常的。現在很多人認為他們在他們的真菌界內可以構成一個單獨的門，并且可以作為通過適應他們的細胞內寄生的生活方式而失去線粒體及其他細胞器的簡約型代表。這不僅可以用基因序列的同源性分析證明，而且與單核生物（微孢子蟲）和雙核生物（真菌）的減數分裂周期具有類似的步驟。
在我們研究中對蝦腸孢蟲的感染主要發生在幾種病毒或是淋巴器官及造血組織的病原體感染中。在正常的小蝦中感染的相對不是那么頻繁。因此在自然界中宿主的免疫系統被病原體破壞而微孢子蟲感染就有可能發生了，例如,人類和哺乳動物中出現的十二指腸和回腸腸上皮細胞感染的AIDS患者就是源于慢性免疫抑制所致。
圖四、對蝦腸孢蟲在斑節對蝦肝小管上皮細胞中的透射電子顯微鏡照片
（A）孢子細胞在孢原細胞核外圍，早期為空泡狀（星號所示），有五個不成熟表面有細絲的部分（箭頭所示），還有一個濃密的帽子形的錨盤結構（箭頭所示）。
（B）后期包子細胞表面有成熟的極絲（箭頭所示）
N：細胞核；PV：后空泡
圖五對蝦腸孢蟲的孢子發育周期透射電子顯微鏡照片
（A）表面覆蓋著合胞體膜的未成熟孢子（箭頭所示）。
（B）未成熟孢子圖示：錨盤（AD），極絲（PF），極質體（PO）包括薄層狀的部分（LPO）。
（C）成熟孢子下面錨盤的橫切面展示了極絲（PF）的交叉面被薄層狀極胞體（LPO）包圍，和極胞體外極絲的縱切面。
（D）成熟孢子顯示了極絲纏繞部分的截面。C和D具有相同的比例尺。（利洋公司高雪譯）
附文章原文，懂英語的朋友有興趣可以看看
