由蠟樣芽孢桿菌引起的細菌性白斑病是凡納濱對蝦半精養出現的新型疾病
S.Velmurugan（印度，2015年）
摘要
在印度南美白對蝦養殖業現在正面臨著一個嚴重的新型細菌病，即白斑病（WPD）。感染疾病后，死亡率隨著感染天數逐漸增加。但是一旦嚴重的疾病暴發來臨，養殖場南美白對蝦的死亡率在3-5天內將超過70%，主要癥狀是頭胸甲上有不透明的白色斑塊、壞死、體色淡藍、食欲不振、肌肉發白。對染病的蝦進行革蘭氏染色，發現病原體是桿狀菌。基因組鑒定證實，WPD的致病病原菌為蠟樣芽孢桿菌（GenBank登錄號：KF673474.1）。引起WPD的蠟樣芽孢桿菌具有較高的致病因子包括溶血活性、脂肪酶活性。南美白對蝦和鹵蟲在細菌濃度為10的4次方到8次方cfu/mL時，死亡率較高。
1、前言
印度的對蝦產量主要來源于斑節對蝦，2004年產量為125000噸，但2008年迅速下降到75000噸。產量的下降主要是由斑節對蝦的繁育和疾病問題導致的，且其種質的衰退也促使印度政府從太平洋地區引進無特定病原******的南美白對蝦。因為它被報道具有高抗病性，高生長速度，對高密度的持續耐受性強，適應低鹽低溫(Remanyetal.,2010)。養殖戶通過養殖南美白對蝦已經取得了巨大成功并獲得了高利潤，這使得南美白對蝦成為了一個重要的從國外引進的養殖物種（Palanikumar等，2011）。
不幸的是，在印度的內洛爾牛、普拉喀桑縣、Gundur、克里希、西戈達瓦里河、東戈達瓦里區的安得拉邦、納格伯蒂訥姆、Sirkali、Cudalore、韋蘭卡尼、泰米爾納德邦的Pudukottai和Poneri區，南美白對蝦養殖場正面臨一個嚴重的新型的細菌性疾病。在對蝦的養殖過程中染病后，隨著養殖天數的增加，死亡率慢慢增加。一旦爆發，蝦的存活率很低，FCR較高。有時當疾病爆發后，南美白對蝦在2-3天內會出現非常嚴重的死亡，使得養殖戶不得不提前清塘，對養殖戶造成了重大經濟損失。最重要的癥狀為：尾部橫紋肌和腹部肌肉組織壞死；壞死的區域表現為白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點或者碎片；蝦體色變成淡藍色；食欲不振；有時候體表粗糙，體色變紅或不變色；肌肉發白。許多死蝦顯示，其外部骨骼完整，但內部組織卻缺失了很多，就好像是被吃了或者是內部退化造成的。在疾病急性發生期，南美白對蝦的死亡率高達70%。
組織學和基因組鑒定結果表明，該白斑病的病原體為革蘭氏陽性桿狀細菌—蠟樣芽孢桿菌。幾個蠟樣芽孢桿菌菌株已經被確定為不同食物中毒類型的病原體(Ehling-Schulzetal.,2004)。目前的工作目的是確定和描述養殖南美白對蝦白斑病（WPD）新的細菌病原體。
2、材料和方法
2.1南美白對蝦樣品
瀕死的蝦來自安德拉邦的Tanuvtur、Prakasam區域的半精養蝦場，其死亡是由細菌感染引起的。瀕死的蝦在無菌的條件下，用無菌的聚乙烯袋裝充氧的養殖池塘水，其水溫為26±28°C，在一小時內送到安德拉邦的翁戈爾區域的實驗室內。瀕死蝦的主要癥狀：甲殼有白色不透明的斑塊，壞死，體色淡藍色，食欲不振，肌肉發白。
2.2疾病爆發時的水質和理化參數
對發病池塘水取樣，對水質參數，包括鹽度、溶解氧（DO）、pH值、堿度（alkalinity）、硬度（hardness）、氨氮，按照巴斯卡蘭（1964）的標準進行分析，如表1。
2.3細菌分離
2.4篩選WSSV
2.5致病因素
2.5.1累積死亡率
為了研究致病細菌病原體的毒力，對南美白對蝦的仔蝦、成蝦和鹵蟲成蟲進行病原微生物感染實驗。
2.5.2細胞外毒力因子
蛋白水解活性、溶血活性、明膠酶檢測、脂肪酶檢測。
2.6細菌鑒定方案
2.6.1表型鑒定
2.6.2蝦組織樣本革蘭氏染色
2.7數據分析
P≤0.001，顯著。
3、結果
3.1感染蝦的病理變化
在南美白對蝦感染白斑病的前期，每天的死亡緩慢增加，但其攝食率較高。感染蝦的臨床癥狀是：（一）尾部橫紋肌和腹部肌肉組織壞死；（二）壞死的區域表現為白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點或者碎片；（三）蝦體色變成淡藍色；（四）食欲不振；（五）有時候體表粗糙，體色變紅或不變色；（六）肌肉發白；（七）許多死蝦顯示，其外部骨骼完整，但內部組織卻缺失了很多，就好像是被吃了或者是內部退化造成的。在疾病急性發生期，南美白對蝦的死亡率高達70%（圖1）。
圖1由細菌引起的太平洋南美白對蝦白斑病（WPD）大規模爆發，箭頭表示甲殼上的白斑。
3.2細菌分離
每個池塘均分離出了4個優勢菌種，它們分別命名為：池塘-I的為PI-1、PI-2、PI-3和PI-4；池塘-II的為PII-1、PII-2、PII-3和PII-4；池塘-III的為PIII-1，PIII-2，PIII-3和PIII。鑒定知：菌落的PI-3，PII-2和PIII-2具有相同的形態。分離鑒定從每個池塘中挑選10尾蝦進行分離（表2）。
右上角標a的蠟樣芽孢桿菌在所有篩選出來的蝦上均分離出了
3.3篩選WSSV
對感染白斑病的蝦進行DNA的PCR擴增，從三個池塘取樣的蝦，其結果均為陰性（見表3）。
3.4致病因子的研究
南美白對蝦成蝦、仔蝦和鹵蟲感染從白班病中分離的不同細菌，導致的累積死亡率見表4。細菌感染蝦和鹵蟲時，PI-3、PII-2和PIII-3能夠有效的殺死它們。用PI-3感染仔蝦、成蝦和鹵蟲時，其累積死亡率分別為92.4%、100%和100%。而PII-2感染時，則分別為96.6%、100%和98.50%。但PIII-2感染時，其死亡率（95％至100％）更高。單因素方差分析結果表明，對蝦和鹵蟲感染，其結果在不同的細菌間差異顯著（P≤0.001）。
用108cfu/ml的從白斑病分離的細菌感染仔蝦、成蝦和鹵蟲后的累積死亡率。右上表字母相同表示差異不顯著（單因素方差分析）。
3.5疑似細菌性病原體鑒定
3.5.1表型鑒定
結果表明，被鑒定的細菌（PI-3，PII-2和PIII-2）為革蘭氏陽性菌，游動，能夠形成內生孢子，對甲基紅、過氧化氫酶試驗、淀粉水解、氧化酶試驗、酪氨酸瓊脂和酚紅葡萄糖溶液等呈陽性；它們對伏-伯氏檢測、吲哚生產、檸檬酸利用率、尿素酶試驗和硝酸鹽還原等呈陰性。這三株菌株都有分解碳水化合物，抵抗溶酶菌，產生溶血毒素的能力。根據形態、生理生化實驗鑒定，確定這三株細菌為同一種蠟樣芽孢桿菌（表5）。
3.5.2蝦組織樣本的革蘭氏染色
革蘭氏染色的結果表明，圖2的a和b顯示，在感染了白斑病蝦的尾部腹肌中可以清楚的看到桿狀的革蘭氏陽性菌。
40×放大倍數，箭頭指示桿狀菌
3.5.3基因水平鑒別致病菌病原體
NCBIBLAST搜索分析表明，該WPD致病病原體與蠟樣芽孢桿菌相符。其16SrRNA基因序列，通過系統進化樹分析表明，WPD致病蠟樣芽孢桿菌與其它蠟樣芽孢桿菌的同源性為98%，如B.cereusIAM。WPD致病蠟樣芽孢桿菌與其它同源性較高的蠟樣芽孢桿菌依次為Y-TSB18、BAB2832、XX2010，等（圖3）。WPD致病蠟樣芽孢桿菌序列已經被收錄在NCBI數據庫了，GenBank中其名稱為白斑病（WPD）蠟樣芽孢桿菌，登錄號為KF673474.1。
4、討論
2012年，白斑病的危害在印度的南部—安德拉邦發生的很緩慢。到了2013年，它已經蔓延到了安德拉邦的其它區域，包括內洛爾，Prakasam，Gundur，克里希納，WestKodavariandEastKodavari區域。也蔓延到泰米爾納德邦的納格伯蒂訥姆，Sirkali，Cudalore，Velankanni，Pudhukottai區域。目前，在安得拉邦和泰米爾納德邦的南美白對蝦半精養養殖場爆發了該疾病。此前（即2012年），僅在夏季爆發白斑病導致死亡。后來在2014年的冬天和夏天均爆發了此病。另外，在本研究中，白斑病導致的癥狀中，首先出現的是尾部橫紋肌肌肉組織壞死，壞死的區域表現為白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點或者碎片。Wangetal.(2000)做了一些工作，他發現，在馬來西亞半島的斑節對蝦養殖場，枯草芽孢桿菌導致了細菌性白班綜合癥（BWSS）。被感染的蝦上面有類似于白班綜合癥（WSSV）引起的白色斑點，還有大量的桿狀細菌存在。
在本研究中，從三個不同的池塘分離出12株細菌，分別進行毒力研究，以確定南美白對蝦的真正致病源。從每個池塘取10尾蝦進行WSSV檢測，均成陰性。在30尾實驗蝦中（來自三個池塘），均檢測到了芽孢桿菌屬的細菌（PI-1，PII-2和PIII-3），后來證實引起白斑病（WPD）的是蠟樣芽孢桿菌。實驗的結果表明，細菌PI-1，PII-2和PIII-3具有較高的毒力，在3天內能夠有效的殺死實驗蝦和鹵蟲。對蝦肌肉的革蘭氏染色結果證實，在WPD病蝦橫紋肌中有革蘭氏陽性桿菌。基于這些結果，細菌PI-1，PII-2和PIII-3被確定為WPD的致病原。Wangetal.(2000)早期的工作也證明，枯草芽孢桿菌導致了斑節對蝦的細菌性白班綜合癥（BWSS），它是通過顯微鏡和PCR研究確定的。
本研究中，PI-1，PII-2和PIII-3具有較高的蛋白水解，溶血，明膠酶和脂酶活性。這表明它們具有裂解蝦角質層的能力，其角質層由蛋白，殼多糖，碳酸鈣和脂質構成（Branson,1993;Dennell,1960）。患WPD的蝦，其甲殼上有白色不透明的斑塊。之后，白色的斑塊變成黑色斑點或者碎片，最后粗糙不平。蠟樣芽孢桿菌是一個重要的食源性產腸毒素的致病菌，已經從魚的樣品中分離出來了，并找到了其負責毒力的基因(Dasetal.,2009)。枯草芽孢桿菌被報道為分泌多種酶，主要是蛋白酶，淀粉酶，葡聚糖酶和脂肪酶(Formigonietal.,1997;Shady,1997)。Hendriksenetal.(2006)證明，土壤沉積物中蠟樣芽孢桿菌的豐度存在hlyII基因。在其有天然宿主且溫度條件適宜時，hlyII基因表達毒力因子。在我們的研究中，可能是環境條件不利導致的疾病爆發。不利環境下，溶血因子直接通過且表達。Andreevaetal.(2007)指出，hlyII基因表達和作用的最佳溫度為15至28℃。hlyII基因它可在甲殼動物體內作用(Sinevaetal.2009)。
根據表型和基因組水平鑒定WPD的致病病原體（PI-1，PII-2和PIII-3），被確認為蠟狀芽孢桿菌，并收錄在NCBI數據庫（GenBank登錄號：KF673474.1）。基于上述的鑒定和分子表征，蠟樣芽孢桿菌是普遍存在的桿狀內生孢子增殖(DeJongheetal.,2008)，它廣泛存在于環境中，包括土壤和粘土、沙、塵、礦物水、加工過的食品等(Goepfertetal.,1972;Johnson,1984;Norrisetal.,1981)。昆蟲的腸道被建議為蠟樣芽孢桿菌棲息地，其孢子可以在里面萌發成蠟樣芽孢桿菌。之后，從土壤節肢動物的腸道內分離并鑒定出了蠟樣芽孢桿菌(Margulisetal.,1998)。基于蝦組織革蘭氏染色、毒力因子、表型、基因組水平鑒定，得出的結果是：導致南美白對蝦白斑病WPD的致病原為蠟樣芽孢桿菌。