David D. Kuhn 美國 2010年
摘要：在對蝦的養殖中，硝酸鹽（NO 3- ）的慢性毒性尚無證據可查。要解決這個問題，就在實驗室循環水養殖系統中，確定它對南美白對蝦的生長、存活、系統中總的對蝦數量（對蝦生物量）、蝦須長度和組織病理變化的影響。第一個實驗（A）養殖6周的時間，養殖鹽度為11‰，對照組（A）的硝酸鹽（NO 3- ）濃度為35 ppm，其它組的硝酸鹽（NO 3- ）濃度分別（A1）220ppm、（A2）435ppm、（A3）910ppm。在存活率、生長、對蝦生物量、蝦須長度方面，對照組A與A1組間的差異均不顯著。A2組與A組間，在存活率和生長方面差異不顯著，但在對蝦生物量和蝦須長度方面差異顯著（P<0.05）。最后，A3組與A組間，在存活率、生長、對蝦生物量、蝦須長度方面的差異均顯著（P<0.05）。對照組和A1、A2、A3的組織病理學表明其肝胰臟出現了損傷，在3個試驗組中有極少數的蝦鰓異常，如掛臟。第二個試驗（B），養殖5周的時間，來評價養殖鹽度變化時，硝酸鹽（NO 3- ）濃度升高的影響。試驗對照組（B）的養殖鹽度為9‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為18ppm。B1組的鹽度為9‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm。B2組的鹽度為2‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm。B3組的鹽度為18‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm。不考慮鹽度時，B1、B2、B3組與對照組B相比，它們之間在存活率、生長、對蝦生物量方面差異顯著（P<0.05）。盡管 B1、B2、B3組蝦對升高的硝酸鹽（NO 3- ）濃度，為440ppm，表現出了消極反應。但在硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm時，隨著養殖鹽度的升高，蝦的存活率和對蝦生物量顯著增長（P<0.05）。
1 前言
2 材料與方法
2.3 實驗設計
兩個實驗均有四個水平，每個水平三個平行。實驗A為在升高硝酸鹽，養殖鹽度為11‰時，對南美白對蝦養殖42天進行研究。對照組（A）的硝酸鹽（NO 3- ）濃度為35 ppm，其它組的硝酸鹽（NO 3- ）濃度分別（A1）220ppm、（A2）435ppm、（A3）910ppm。實驗B養殖35天，不同養殖鹽度下，對硝酸鹽的濃度對南美白對蝦的影響進行研究。試驗對照組（B）的養殖鹽度為9‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為18ppm。B1組的鹽度為9‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm。B2組的鹽度為2‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm。B3組的鹽度為18‰，硝酸鹽（NO 3- ）濃度為440ppm。
2.4 水質
養殖水體是用井水和海水晶調配而成（海水晶產自美國）。硝酸鹽的水平在實驗室內用硝酸鈉來控制（舍爾化工，美國）。一些硝酸鹽在實驗中會自然積累，水體的蒸發也會使得硝酸鹽的濃度升高。因此，在實驗中，在同一時間向每個玻璃缸中加入等量的水，以補充蒸發損失的水。實驗中，水質檢測方法和樣品取樣數量見表 1。
3 結果
3.1 不同程度的硝酸鹽對蝦的影響
同預期的一樣，在硝酸鹽的各個水平，每組間的差異均顯著（P<0.05）（表2）。水質指標沒有觀察到差異，這使得各組間的比較有意義。
表2 水質指標及A和B的單因素方差分析，上標表示差異顯著。
實驗A的存活率在硝酸鹽大于220ppm時受到影響（圖1）。最終的存活率分別為：A 組87.1±4.0％，A1 組87.4±9.5％，A2 組64.2±10.7％，A3組 14.6±4.2％。在14天后，A3組的存活率要顯著低于A組、A1組和A2組的。
圖1 A實驗存活率情況
蝦的生長與硝酸鹽的水平呈負相關，從養殖的21天起，各組間生長的差異顯著（P<0.05）（圖2）。實驗結束時，A3組的蝦要顯著小于其它組的。最終的生長率分別為：A 組1.00±0.12克/周，A1 組0.84±0.06克/周，A2 組0.70±0.13克/周，A3組0.24±0.18克/周。
圖2A實驗生長情況
蝦的生物量變化如圖3。養殖14天后，各組間生物量的差異顯著（P<0.05），且生物量與硝酸鹽的水平呈負相關。最終的生物量分別為：A 組158±7 g/缸，A1 組138±24 g/缸，A2 組86±14 g/缸，A3組41±25 g/缸。
圖3A實驗生物量情況
硝酸鹽濃度的升高，對蝦須的長度產生負面影響（見表3）。A組的蝦須長度顯著長于A2組和A3組（P<0.05），A3組蝦須的長度要顯著短于其它組的（P<0.05）。
表3A實驗蝦須長度的情況
A實驗中，A1組、A2組、A3組的肝胰臟中均有病灶（圖4）。肝胰腺管呈各種病變，一些肝胰腺管數目和尺寸減小，變為儲存脂質的空泡。還有一些肝胰腺管缺乏上皮細胞，導致其膨脹擴張。這兩種肝胰腺管都含有脫落的上皮細胞和細胞碎片。還有一小部分的肝胰腺管中有類似肉芽腫外觀的東西，是壞死的、以細菌填充為中心的物體。從A1組到A3組，僅有極少數蝦的鰓異常（圖5）。細菌和沒有固定形態的碎片，在許多蝦的鰓絲上積累，而一些鰓的柱狀上皮結構出現了損傷。
圖4 實驗A中，硝酸鹽升高后，肝胰臟典型的病變，放大250倍的照片。一部分的肝胰腺管中有類似肉芽腫外觀的東西，是壞死的、以細菌填充為中心的物體（g）。而其它小管擴張，缺乏上皮細胞（X）。這兩種類型的小管在不同程度上含有脫落、壞死的上皮細胞和細胞碎片。
圖5 實驗A中，硝酸鹽升高后，蝦鰓典型性的掛臟，放大倍數為500倍。細菌和沒有固定形態的碎片，在許多蝦的鰓絲上積累（*），而一些鰓的柱狀上皮結構出現了損傷（箭頭）。
3.2 實驗B：提高硝酸鹽濃度在不同鹽度下的影響
正與預期的那樣，當硝酸鹽變化時，鹽度對各組的影響均顯著（表2）。盡管溶氧和亞硝酸鹽在各組間差異顯著（P<0.05），但溶氧和亞硝酸鹽的平均值均分別大于5.75 ppm或者小于0.26 ppm。
養殖一周后，實驗B的存活率在各組間差異明顯（P<0.05）（圖6）。B2組在養殖14-21天時，死亡率出現了100%。在養殖的28天，存活率在所有的組別都顯著的低于對照B組（P<0.05）。在硝酸鹽濃度升高時，蝦的存活率與鹽度呈負相關。最終的存活率：B組 81.5±4.9%，B1組16.7±11.1%，B2組為0，B3組44.4±5.6%。
圖6B實驗的存活率情況
在硝酸鹽濃度升高時，蝦的生長與鹽度呈負相關。且在養殖14天之后，各組間生長的差異顯著（P<0.05）（圖7）。對照B組的生長速度最快。蝦在硝酸鹽水平較高時，其生長速度在鹽度為9和18時（即B1與B2組之間），它們之間的差異不明顯。在B2組，養殖14天時，蝦沒有生長。養殖到20天時，全部死亡，死亡率為100%。最終的生長情況：B組1.07±0.06克/周，B1組0.51±0.08克/周， B3組0.59±0.11 克/周。
圖7B實驗中單個蝦體重的情況
蝦的生物量變化如圖8。在養殖7天后，B組與其它組間差異顯著（P<0.05）。在硝酸鹽濃度升高時，鹽度降低，對蝦的生物量有負面影響。最終的生物量情況：B組114±2 g/缸，B1組15±24 g/缸，B3組41±4g/缸。
圖8實驗B的蝦生物量的情況
4 討論
本研究表明，在養殖鹽度為11，硝酸鹽的濃度為220ppm時，蝦可以養殖6個星期。同時，硝酸鹽的濃度為435ppm，對蝦的養殖是不安全的。蔡和陳在 2002年，根據Sprague1971年的實驗數據，設計了斑節對蝦的硝酸鹽急性毒性試驗的濃度梯度。在養殖鹽度為15時，硝酸鹽的安全濃度在南美白對蝦養殖時估測為145ppm。盡管沒有發表的文獻表明硝酸鹽的毒性，但是有文獻對南美白對蝦硝酸鹽的安全濃度做出了建議。Van Wyk在1999年提出，對蝦養殖硝酸鹽的安全濃度要低于60ppm，但是沒有提供科學依據。本實驗從數據上支持了這一說法，但是他提出濃度的3.5倍以上（硝酸鹽濃度220 ppm）。硝酸鹽濃度在220 ppm，蝦養殖幾個星期后，蝦的產量可能不會降低。當考慮到水和其它方面（如，能源使用，鹽，水排放等）的資源節約的循環水養殖操作時，這種差異是顯著的。如，若硝酸鹽的含量是主要的關注變量，那么蝦農在理論上就可以減少一半的換水率。
本實驗對蝦須長度進行了評估，因為它反映了蝦的整體健康情況。蝦須的主要作用是觸角和感官知覺(New et al., 2010)。此外從活蝦市場的角度考慮，有些消費者可能不接受蝦短須(Gardner, 2010)。當硝酸鹽的濃度在435ppm以及更高時，蝦須的長度不被接受，因為要顯著短于低濃度的。蝦須損傷或較短，是蝦不健康的早期癥狀(FAO, 2001)。或許，在本研究中，升高硝酸鹽的濃度，打破了蛻皮激素內分泌的控制。在甲殼類動物中，記載了蛻殼和再生附屬物是相互關聯的(Madhavan and Madhavan, 1981)。盡管目前確切的機理尚不清楚，當蝦在高水平的硝酸鹽濃度的環境中持續一段時間后，蝦須就沒有再生的能力了。
實驗A的3個處理組，在硝酸鹽濃度升高時，均表現出了不同程度的組織病變，尤其是肝胰臟和鰓。一些肝胰腺管數量減少，形成儲存脂質的空泡。還有一些小管擴張，缺少上皮細胞。這表明蝦可能攝食不正常或者代謝異常(Villalon, 1993)。還有少數的肝胰腺管內出現了肉芽腫狀的物體，表明它對損傷產生了炎癥反應或者損傷的肝胰腺細胞、上皮細胞對損傷組織進行包被 (Jiravanichpasal and Miyazaki, 1994; Estevea and Herrerab, 2000)。細菌和形狀不規則的碎片，在許多蝦的鰓絲上積累。這個可能是蝦的清洗活動較少，或者是水中的懸浮物質較多造成的(Bauer, 1977, 2002; Martin et al.,2000)。有少數的蝦鰓掛臟，報道說鰓掛臟會影響鰓部的水體交換，最后對蝦體的健康造成不利影響(Bauer, 1979)。所有的這些變化表明，硝酸鹽濃度的升高對蝦的健康造成了不利影響，盡管蝦體的表面體征不明顯。實驗B表明，硝酸鹽在鹽度較高的毒性較低。這些結果與其它報道的，除了硝酸鹽以外的含氮廢物毒性的強弱變化，隨鹽度的變化相一致(Linand Chen,2001;KirandKumlu,2006;Lietal.,2007)。對于硝酸鹽來說，,Tsai and Chen在2002年發現，當養殖鹽度從35降低到15ppm，硝酸鹽對斑節對蝦的毒性增強。雖然高鹽度對含氮物質的毒性的抑制作用還沒有搞明白，但據說，海蝦在低鹽度的環境中，它會受到附加的壓力，代謝和其它相關物理過程會受到壓制。蝦的等滲點為18.5ppm，Castille and Lawrence在1981年報道其平均值在24.6ppm，Wyban and Sweeney在1991年報道其在10-15 ppm。離子交換（包括硝酸鹽）的主要地點在蝦的鰓部(Pequeux, 1995)。對蝦在低鹽度時，其血淋巴需要保持較高的滲透壓對抗環境。如果這時是低滲狀態就需要額外的消耗能量(Pequeux, 1995)。因此，毒性物質在長期威脅或短期之間進行比較時，少量的能量還是能夠用來抵御毒性的。此外，低鹽度時，在體內滲透壓條件較低時，可以將水體中過多的硝酸鹽吸入體內，對體內的滲透壓進行調整(Mantel and Farmer, 1983; Kir and Kumlu, 2006)。
抑制生長和死亡的原因可能主要包括代謝阻礙、攝食率降低以及損傷內分泌功能(Kurihara et al., 2008)。在水產養殖中，人們普遍認為毒物在導致其死亡前，抑制其生長。然而，在本實驗中，硝酸鹽濃度升高，對存活率的影響程度要大于對生長速度的影響。這一點尤其值得注意，因為蝦農通常是依賴準確的生長數據，但確得不到準確的養殖數量，因為想知道養殖池塘中具體有多少蝦比較困難。
5 結論
總體上，這個硝酸鹽的慢性毒性研究表明，在養殖鹽度為11，硝酸鹽濃度大于220ppm時，硝酸鹽對南美白對蝦的存活、生長和對蝦生物量產生負面影響。硝酸鹽的濃度在循環水養殖中已經報道超過了450ppm (Kuhn et al.,2009; Samocha Et al., 2010)。硝酸鹽對存活率的抑制要超過對生長率的抑制。鹽度降低，硝酸鹽的毒性增強。硝酸鹽對蝦的慢性影響主要包括抑制蝦須的生長、損傷肝胰臟，還有少數蝦的鰓異常，如掛臟。本研究有助于水產從業者和蝦農更好的管理養殖系統，避免硝酸鹽帶來的危害。
譯者：利洋公司技術部 陳明衛