豬流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道感染病。流感病毒屬于正黏病毒科，包括A、B、C、托高土病毒屬4個屬。A型流感病毒可以傳染多種動物，包括很多禽類和哺乳動物。B型和C型病毒似乎只能從人體內分散到，雖然也從豬體內分散到了C型流感病毒[1]，但傳染豬的首要照舊A型流感病毒。早在1918年，美國、匈牙利和中國就有關于豬流感的報道，這與1918年西班牙人類大流感的時間一致。今朝該病呈世界漫衍，但首要以處所性風行為主。純粹的SIV傳染體現為發病率高(100%)。病死率低(約5%)的特點，其嚴重水平與風行毒株、豬的日齡和康健狀態、情況前提及細菌性繼發傳染相干。豬流感不僅危害豬體康健，同時影響育肥豬的上市時間，并增長豢養成本，對養豬業造成的喪失不容忽視。<?XML:NAMESPACE PREFIX = O />
豬流感病毒不僅對豬體康健和養豬業危害大，在整個流感病毒的遺傳進化和生態漫衍中都占據緊張職位，出格是對人類康健具有潛在的威脅。雖然比年來產生了多起禽流感病毒傳染人并引致疾病以致滅亡的事例[2]，但一般認為流感病毒具有種屬特異性，即禽流感病毒很難沖破種間屏蔽直接傳染人[34]。2006年底，無錫某豬場產生差別水平的呼吸體系疾病，本研究對從該豬場分散的一株具有血凝特征的毒株H1N1，操縱RTPCR擴增HA基因。經遺傳闡明表白，該分散株屬古典型H1N1，極可能在人畜禽間彼此流傳。
1 質料與要領
1.1 質料
新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9N2、豬流感病毒H3N2、人源流感病毒PR8株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所惠贈。A/Swine/Wuxi/1/07(H1N1)病毒株分散于江蘇無錫地域某發病豬場鼻拭子樣品；SPF雞胚(9日齡)購自山東SPF雞胚孵化場。
1.2 載體與首要試劑
pGEMT easy載體、T4 DNA毗連酶、RTPCR試劑盒購于美國Promega公司；凝膠回收DNA試劑盒購于德國QIAGEN公司；EcoRⅠ酶購自MBI公司。
1.3 HA基因的擴增
1.3.1 病毒RNA提取 通過SPF雞胚擴增上述病毒，網絡尿囊液，經濃縮后接納Trizol試劑提取各病毒RNA。吸取250 μL病毒液至1.5 mL用DEPC水處置懲罰過的Eppendorf管中，插手750 μL Trizol試劑，混勻后置15 ℃～30 ℃感化5min；插手0.2 mL的氯仿，用手劇烈搖15 s，室溫靜置5 min；于4 ℃ 以12 000 r/min離心15 min；取上清于另一個Eppendorf管中，插手500 μL的異丙醇，室溫感化10 min，于4 ℃以12 000 r/min離心10 min；棄上清，插手750 mL/L的乙醇1 mL漂洗2次；干燥后用DEPC水重懸，－20 ℃生存備用。
1.3.2 分散株亞型判定 別離接納Choi等成立的判別H1和H3亞型的RTPCR法對分散株舉行亞型判定。判別H1和H3亞型的兩套引物序列為：HF1：5′GGGACATGTTACCCAGGAGAT3′，HR1：5′GCATTGTATGTCC AAATATCCA 3′，HF3：5′TATGCCTGGTTTTCGCTCAA3′，HR3；5′TTCGGGATTACAGTTTGT TG3′。第一套引物擴增片斷長度為1 006 bp，為H1亞型特異性；第二套引物擴增片斷長度為663 bp，為H3亞型特異性。PCR反映參數為：94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s,30個輪回；72 ℃延伸10 min，4 ℃生存。
1.3.3 HA的引物設計 按照已頒發的豬流感H1N1 HA序列設計上游引物P1：ATG AAA GCA AAA CTC CTG ATC CTG T；下游引物P2：CAG ATG CAT ATT CTA CAC TGC AAA，以尿囊液提取的RNA為模板擴增HA基因。
1.3.4 HA全基因片斷的RTPCR 按Promega
公司的AMV RTPCR試劑盒操作申明書舉行，反映體積為25 μL。反映混淆物包括RNA模板5 μL，上下游引物各0.1 μmol/L，AMV逆轉錄酶2.5 U，Taq DNA聚合酶2.5 U，RNA酶抑制劑20 U，dNTP混淆物1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L。舉行反映時，起首逆轉錄反映50 ℃ 30 min，然后94 ℃ 2 min，使逆轉錄酶失活，再舉行通例PCR。
1.4 重組質粒的構建及判定
PCR產品經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，別離操縱QIAGEN公司凝膠回收試劑盒回收，與pGEMT easy載體按1∶8(摩爾比)于4 ℃毗連12 h，轉化DH5α，用AIX(含有0.1 mg/mL Amp， 0.1 mg/mL IPTG，0.02 mL Xgal)LB平板藍白斑篩選，提取白斑的質粒DNA，用Eco RⅠ酶切判定，篩選陽性克隆。
1.5 序列闡明
通過DNA Star軟件和BlastN軟件闡明HA基因的遺傳特征，闡明該分散株的遺傳配景和來歷。
2 成果
2.1 HA基因RTPCR擴增成果
通過RTPCR要領的擴增成果可見，該病毒為H1亞型流感病毒，操縱H3的特異性引物不能擴增得到HA，而通過H1特異的引物舉行擴增，則可見1.7 kb的陽性條帶，將該片斷克隆入T載體中，用EcoRⅠ單酶切，將陽性的克隆測序。成果顯示，該場分散的病毒為H1N1分散株(圖1)。
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1.THA酶切判定成果；2.DNA尺度10 000
1.THA digested by EcoRⅠ；2.DNA Marker 10 000
圖1 HA基因克隆入T載體
Fig.1 Subcloning of HA gene into pGEMT easy vector
2.2 遺傳進化闡明
通過RTPCR擴增H1N1 HA基因，將其克隆入T載體，經測序判定，與GenBank中其他分散毒株舉行比力，發明該分散株為人型H1N1，與古典H1N1 PR8毒株同源性最高(圖2)。
圖2 體系進化樹闡明
Fig.2 Analysis of the phylogenetic tree
3 接頭
世界各地風行的SIV包括3種首要的亞型，即H1N1、H3N2和H1N2亞型，個中包括差別的基因型，即古典豬H1N1、類禽H1N1、類人H3N2、基因重配的H3N2以及多基因型的H1N2亞型。別的，H1N7、H4N6、H9N2、H5N1和H3N3等亞型病毒也從豬體內分散到，但都未在豬群中引起流傳。我國比年來不停有SIV分散的報道，但SIV在我國的風行環境仍舊不清晰[57]。
通過對豬體內分散到的H1N1流感病毒的HA舉行進化樹闡明，表白古典型H1N1 SIV，與類人H3N2流感病毒一樣，持久存在于我國豬群中。早在1976到1982年，中國南邊豬群中SIV監測發明，古典H1N1 SIV和類人H3N2病毒配合存在。郭元吉等[89]從北京某豬群中分散到古典豬H1N1病毒，這是在中國大陸的初次報道。Guan Y等[10]在中國豬群中發明了類禽H1N1病毒，但沒有造成風行。本研究從無錫市豬群中分散到1株SIV，進一步證明人型H1N1亞型流感存在于豬群中，表白我國豬群中的流感病毒有傳染人類的可能性。因此，在豬群中，火急需要成立持久有用的監測。
豬被認為是禽、人流感病毒的中心宿主和基因混淆器。豬因為呼吸道上皮同時具有2種類型的流感病毒受體[4]，因此人和禽流感病毒都可以傳染豬，這就為禽流感病毒傳染人提供了兩種可能。其一，禽流感病毒在豬體順應后得到了傳染人的能力；其二，這為禽流感病毒與人流感病毒產生基因重配提供了時機，這種含有禽流感病毒基因的重配病毒可能傳染人并引起風行。別的，豬也可能成為人流感病毒(H1N1和H3N2亞型)的貯存宿主，一些人流感病毒亞型在人群中消散后，可以在豬群中連續存在，成為人流感的潛在感染源[5]。以是豬流感也是一種值得器重的人獸共患病。
比年來，豬呼吸道疾病在我國很多處所豬場頻仍產生，癥狀與外洋風行的呼吸道疾病(porcine respiratory disease complex， PRDC)相似，病原較為龐大。在對SIV的研究中，很多流感病毒是從外觀康健的豬體內分散到的[5,10]，SIV一旦傳染豬群就很難革除，SIV可以在豬群中連續存在[5]。本研究收羅的樣品來自患病豬群，在SIV分散陽性的豬群中可能還存在其他病原的混淆傳染，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)等。而我外洋觀康健豬群中的SIV風行環境若何，則有待進一步研究。