黃志堅1，陳勇貴1，翁少萍1，2，路曉鋒1，鐘立洪1，范文洲2，陳旭凌1，張慧文2，何建國1，2
(1．水產品安全教育部重點實驗室∥中山大學海洋學院，廣東廣州510275；2．中山大學生命科學學院，廣東廣州510275)
摘要：近年來，在中國南方超過50%以上的凡納濱對蝦養殖場在養殖30d后爆發1種疾病，導致80%以上的養殖對蝦死亡。患病對蝦臨床癥狀為肝胰腺萎縮壞死、活動力減弱、對蝦在池塘底部死亡，發病初期水面和池塘邊觀察不到病蝦，因此養殖者通常將該病稱為“偷死病”。患病對蝦肝胰腺萎縮壞死是主要癥狀，因此，我們稱這種對蝦疾病為對蝦肝胰腺壞死癥(HPNS)。2012年3月－2013年10月，我們在中國南方廣東、海南和廣西3個省的12個養殖地區采集具有HPNS癥狀的凡納濱對蝦進行了組織病理觀察、病毒檢測與人工感染、細菌分離鑒定與人工感染研究。組織病理學研究表明具有HPNS癥狀的病蝦肝胰腺壞死，在部分區域肝胰腺管細胞消失，肝胰腺小管間結締組織減少。對305尾HPNS對蝦進行11種對蝦病毒PCＲ檢測，并采用人工病毒感染方式感染健康對蝦，感染對蝦不表現HPNS癥狀。從63尾HPNS病蝦的肝胰腺、血淋巴和腸道分離鑒定383株細菌，這些細菌分別屬于10個屬，49種細菌，每尾對蝦均混合感染多種細菌，其中38尾對蝦中分離到副溶血弧菌，34尾對蝦中分離到蠟樣芽孢桿菌，20尾對蝦中分離到蘇云金芽孢桿菌，19尾對蝦中分離到霍亂弧菌。選取副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌分別采用注射和浸泡方式感染健康對蝦，感染對蝦均出現HPNS癥狀。結果表明多種細菌與凡納濱對蝦HPNS爆發有關。
關鍵詞：凡納濱對蝦；肝胰腺壞死癥；細菌；病毒
凡納濱對蝦現為世界第一大養殖對蝦種，占世界養殖對蝦總產量的70%。中國凡納濱對蝦養殖產量占全球對蝦養殖產量的30%，2012年中國養殖凡納濱對蝦養殖產量達到145.32萬t。近年來，一種稱為早期死亡綜合癥(EMS)或急性肝胰腺壞死綜合癥(AHPNS)的對蝦疾病在中國、泰國、越南、印度尼西亞、印度和墨西哥等地對蝦養殖場中爆發。EMS/AHPNS導致全球對蝦養殖產業嚴重損失。最近在中國南方超過50%以上的凡納濱對蝦養殖場在養殖30d后爆發1種疾病，導致80%以上的養殖對蝦死亡。患病對蝦臨床癥狀為肝胰腺萎縮壞死、活動力減弱、在池塘底部死亡，水面和池塘邊觀察不到病蝦，因此對蝦養殖者通常將該病稱為“偷死病”。肝胰腺萎縮壞死是患病對蝦的主要臨床癥狀，因此，我們稱這種對蝦疾病為對蝦肝胰腺壞死癥(HPNS)。盡管患有HPNS的對蝦與患有EMS/AHPNS的對蝦均表現為肝胰腺壞死，但HPNS對蝦與EMS/AHPNS對蝦不同，EMS/AHPNS是在對蝦養殖早期死亡(一般在7～30d的養殖時間發病)，發病速度快，有報道認為EMS/AHPNS是由1株高致病力的副溶血弧菌致病菌引起對蝦急性大量死亡。與EMS/AHPNS相比，HPNS的爆發和發病進程相對比較緩慢，而且HPNS一般發生在凡納濱對蝦養殖30d以后，池塘養殖對蝦不會在短時間內大量死亡，而是逐漸死亡，養殖到90d左右，死亡率達到80%。
為了研究對蝦HPNS爆發是否跟細菌和/或病毒等因素有關，本文開展了組織病理學、病毒檢測與人工感染、細菌分離鑒定與人工感染等方面的研究。
1材料和方法
1.1肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦樣品采集
于2012年3月－2013年10月分別在中國南方廣東、海南和廣西3個省的12個凡納濱對蝦主要養殖區域收集具有典型HPNS癥狀的病蝦肝胰腺、血淋巴和腸道樣品。為了檢測細菌或病毒病原，病蝦樣品分別在現場進行不同處理和保存。采用無菌操作方法現場取患病凡納濱對蝦的肝胰腺、血液、腸道，用接種環分別在LB、TSA、TCBS、BHI平板培養基上劃線接種，平板培養基密封保存帶回實驗室用于檢測和鑒定細菌。現場采集的病蝦樣品用冰盒冷凍，封裝后帶回實驗室，存放于-80℃凍存用于對蝦DNA病毒檢測和病毒人工感染。同時取對蝦不同組織用RNAlater液(USA)于-80℃保存，用于對蝦RNA病毒檢測。采集患病對蝦樣品同時用Davidson'sAFA組織固定液固定用于組織病理分析。
1.2肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦組織病理觀察
采集36尾HPNS對蝦肝胰腺，Davidson'sAFA組織固定液固定，固定12～24h后換φ=70%酒精保存。將固定的對蝦組織用無菌去離子水沖洗12h，然后用φ為50%、70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明、透蠟，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅(H＆E)染色，光學顯微鏡下觀察并拍照。
1.3肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦病毒PCR檢測
采用酚氯仿法提取HPNS對蝦基因組DNA進行對蝦DNA病毒檢測。采用Trizol法(USA)提取HPNS對蝦總RNA，并用Primescript1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa，Japan)試劑盒進行逆轉錄以檢測HPNS對蝦RNA病毒。針對各種對蝦病毒性病原的高度保守區段設計特異性引物，采用PCR檢測方法分別檢測白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、對蝦桿狀病毒(BPV)、斑節對蝦桿狀病毒(MBV)、肝胰腺細小病毒(HPV)、黃頭病毒(YHV)、桃拉綜合癥病毒(TSV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、莫里恩病毒(MOV)、羅氏沼蝦諾達病毒衛星病毒(XSV)和生長緩慢綜合癥病毒(LSNV)。對蝦病毒檢測所用引物均由Invitrogen公司合成，引物信息見表1。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環后于72℃延伸10min。PCR擴增產物經w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后分析。
1.4病毒人工感染
實驗所用健康凡納濱對蝦(均質量5g)由中山大學海洋生物技術研究開發中心珠海基地提供。選取容積為0.8m3的水族箱，試驗用水為天然海水，水溫28～32℃。選取大小均一適中、活力較好的對蝦放入水族箱暫養3～5d，24h充氣，每天按時喂料并吸污換水，直至對蝦生長狀況穩定。感染試驗分組前，隨機選取10尾試驗對蝦進行對蝦病毒檢測，沒有檢測到病毒的對蝦可進行病毒攻毒試驗。
小心剝離30尾具典型HPNS癥狀的病蝦頭胸甲，稱取病蝦頭胸部用10倍體積的無菌PBS用勻漿器在冰上勻漿，勻漿液在5000r/min離心10min，上清經0.45μm濾膜過濾，10倍體積PBS液稀釋用于對蝦感染。實驗健康對蝦分為過濾組、未過濾組和對照組3個組，每個組設3個平行組，每個平行組30尾對蝦。過濾組和未過濾組分別用0.5mL過濾液和未過濾液稀釋液注射感染健康對蝦，對照組注射等量無菌PBS緩沖液，觀察7d。感染7d后，每個平行組隨機選取5尾對蝦進行病毒檢測。
1.5肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦細菌分離和鑒定
從HPNS病蝦肝胰腺、血淋巴和腸道分離的細菌在LB，TSA，TCBS和BHI不同培養基上28℃培養24h，挑取優勢單一菌落在培養基中再次劃線純化和培養，直至獲得純化的單一菌落。采用傳統微生物學鑒定方法進行細菌鑒定。細菌16SrDNA基因擴增采用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing)提取細菌基因組DNA。16SDNA擴增反應的引物為通用引物，正向引物序列：5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，反向引物序列：5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3'，由上海英駿生物科技有限公司合成。PCR反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環后于72℃延伸5min。PCR擴增產物經w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海英駿公司測序，測序結果用BLAST軟件進行同源性比對，ClustalX軟件進行多序列比對，MEGA4.0軟件進行系統進化樹的構建，以進行細菌種類鑒定和分析。
1.6副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌人工感染凡納濱對蝦
選取來源于HPNS對蝦肝胰腺的副溶血弧菌(VP)和來源于HPNS對蝦腸道的蘇云金芽孢桿菌(BT)，分別采取肌肉注射感染及浸泡感染方式進行凡納濱對蝦肝胰腺壞死癥細菌人工感染。
注射感染對蝦分為4個組，每個組設3個平行組，每個平行組30尾對蝦，分別注射細菌濃度為106cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液50μL/尾，對照組對蝦注射等量無菌PBS，注射劑量均為50μL/尾。浸泡感染也分為4個組，每個組設3個平行組，每個平行組30尾對蝦，感染對蝦分別用細菌終濃度為105cfu.mL－1的VP、BT和VP+BT菌液浸泡，對照組用天然海水浸泡。不同方式感染對蝦觀察14d，記錄對蝦感染癥狀和死亡情況，從感染對蝦中分離和鑒定細菌，同時取感染對蝦組織用AFA組織固定液固定，用常規組織學方法進行組織病理學檢測。
2結果
2.1肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦癥狀和組織病理觀察
患HPNS對蝦的主要癥狀是活力減弱，攝食減弱或不攝食，肝胰腺邊緣不清晰呈彌散狀，最后肝胰腺萎縮壞事(圖1－a，圖1－a')。與健康凡納濱對蝦(圖1－b，圖1－b'，圖1－c)比較，患病對蝦肝胰腺肝小管B，F，R細胞壞死或脫落，肝小管間結締組織松散或壞死，嚴重者肝小管崩解(圖1－d)。
圖1HPNS對蝦癥狀和組織病理觀察
a：具HPNS癥狀的病蝦，箭頭指示病蝦的肝胰腺；a'：具HPNS癥狀病蝦的肝胰腺，箭頭指示病蝦的肝胰腺；b：健康對蝦癥狀，箭頭指示健康對蝦的肝胰腺；b'：健康對蝦的肝胰腺，箭頭指示健康對蝦的肝胰腺；c：健康對蝦肝胰腺組織病理觀察；d：病蝦肝胰腺組織病理觀察，箭頭指示肝小管間結締組織受到破壞
2.2肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦病毒檢測和人工感染
采用PCR方法針對305尾具有HPNS癥狀的患病對蝦進行對蝦病毒檢測攜帶情況。檢測結果顯示，可檢測到WSSV、IHHNV2種病毒，BPV、MBV、HPV、YHV、TSV、IMNV、MOV、XSV、LSNV等其余9種病毒在所有樣品中均未檢測出。其中WSSV一擴中未檢出，僅在二擴中檢出，二擴
檢出率為66.7%，IHHNV僅檢出2例。
選取具典型HPNS癥狀的病蝦頭胸部組織制備組織勻漿液，分別用不經微孔濾膜過濾的組織勻漿液和經微孔濾膜過濾的組織勻漿液注射感染健康對蝦，感染后7d統計結果，未過濾組對蝦死亡率達到100%，表現典型肝胰腺壞死癥狀，過濾組對蝦在實驗期內沒有死亡。對照組對蝦在實驗期內也沒有死亡。感染結果表明病毒不是HPNS的主要病因。
2.3肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦細菌分離鑒定
從63尾具HPNS癥狀的對蝦不同組織中分離鑒定49種細菌，分別屬于10個屬。所有這些細菌中，肝胰腺分離鑒定34種細菌，腸道31種，血淋巴39種(表2)。
其中弧菌屬Vibrio10種，包括副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈維氏弧菌V．harveyi、溶藻弧菌V．alginolyticus、霍亂弧菌V．cholera、河流弧菌V．fluvialis、創傷弧菌V．vulnificus、弗尼斯弧菌V．furnissii、遠青弧菌V．azureus、需鈉弧菌V．natriegens、擬態弧菌V．mimicus；芽孢桿菌屬Bacillus11種，包括蠟樣芽孢桿菌B．cereus、解淀粉芽孢桿菌B．amyloliquefaciens、地衣芽孢桿菌B．licheniformis、蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis、枯草芽孢桿菌B．subtilis、高地芽孢桿菌B．altitudinis、死谷芽孢桿菌B．vallismortis、巨大芽孢桿菌B．megaterium、彎曲芽孢桿菌B．flexus、韓國芽孢桿菌B．koreensis、南海恩施芽孢桿菌B．ensch；氣單胞菌屬Aeromonas7種，包括豚鼠氣單胞菌A．caviae、嗜水氣單胞菌A．hydrophila、維羅納氣單胞菌A．veronii、溫和氣單胞菌A．sobria、斑點氣單胞菌A．punctata、舒氏氣單胞菌A．schubertii、腸棕氣單胞菌A．enteropelogenes；微小桿菌屬Exiguobacterium5種，包括印度微小桿菌E．indicum、金橙黃微小桿菌E．aurantiacum、乙酰微小桿菌E．acetylicum、深海微小桿菌E．profundum、海洋微球菌E．marinum；葡萄球菌屬Staphylococcus6種，包括沃氏葡萄球菌S．warneri、木糖葡萄球菌S．xylosus、巴氏葡萄球菌S．pasteuri、路鄧葡萄球菌S．lugdunensis、松鼠葡萄球菌S．sciuri、腐生葡萄球菌S．saprophyticus；不動桿菌屬Acinetobacter3種，包括約氏不動桿菌A．johnsonii、泛耐藥鮑曼不動桿菌A．baumnnii、溶血不動桿菌A．heamolyticus；希瓦氏菌屬Shewanella3種，包括脫色希瓦氏菌S．decolorationis、海藻希瓦氏菌S．algae、鮑希瓦氏菌S．haliotis；發光桿菌屬Photobacterium2種，包括美人魚發光桿菌P．damselae和鰒發光桿菌P．leiognathi；腸桿菌屬Enterobacter1種，阿氏腸桿菌Enterobacterasburiae；假單胞菌屬Pseudomonas1種，包括彎曲假單胞菌P．geniculate。
在63尾患病對蝦中，38尾對蝦中鑒定有副溶血弧菌V．parahaemolyticus，其余25尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數的60.3%；有蠟樣芽孢桿菌B.cereus的對蝦34尾，其余29尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數的54.0%；有蘇云金芽孢桿菌B．thuringiensis的對蝦20尾，其余43尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數的31.8%；有霍亂弧菌V．cholera的對蝦19尾，其余44尾沒有分離到，占鑒定對蝦總數的30.2%；有金橙黃微小桿菌E．aurantiacum的對蝦14尾，占鑒定對蝦總數的22.2%；有嗜水氣單胞菌A．hydrophila的對蝦11尾，占鑒定對蝦總數的17.5%；解淀粉芽孢桿菌B．amyloliquefaciens的對蝦為7尾，分別占鑒定對蝦總數的11.1%；其他種細菌分別從一些HPNS單尾蝦中分離鑒定(表2)。不同種類細菌可以從不同的單尾HPNS病蝦中分離，單尾HPNS病蝦中最多鑒定細菌9種，最少鑒定細菌3種。以上結果表明多種細菌可能與對蝦HPNS爆發有關。
表263尾HPNS對蝦肝胰腺、腸道和血淋巴中分離鑒定的細菌
2.4肝胰腺壞死癥凡納濱對蝦細菌人工感染
用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌分別注射感染健康對蝦，在感染后6d全部死亡，死亡率100%，表現典型肝胰腺壞死癥狀。對照組死亡率為12%，沒有肝胰腺壞死癥狀(圖2)。用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌分別浸泡感染健康對蝦，感染組對蝦緩慢死亡，在感染后14d統計結果，VP+BT混合菌感染組對蝦死亡率較高，達到75%，VP感染組對蝦死亡率達到66%，BT感染組對蝦死亡率為62%，感染組死亡對蝦表現典型肝胰腺壞死癥狀。對照組死亡率為16%，沒有肝胰腺壞死癥狀(圖3)。
圖2副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌注射感染對蝦的情況
圖3副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT、VP+BT混合菌浸泡感染對蝦的情況
取不同感染方式感染對蝦進行病毒PCR檢測，未檢查到病毒。感染對蝦重新進行細菌分離和鑒定，V1感染組對蝦中分離鑒定出副溶血弧菌，Z7感染組對蝦中分離鑒定出蘇云金芽孢桿菌，V1+Z7混合感染組分離鑒定的細菌有副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌，兩種細菌都可以分別從人工感染對蝦中對應重新分離。這些結果表明副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌都可以感染健康對蝦產生HPNS癥狀。
分別用副溶血弧菌VP、蘇云金芽孢桿菌BT以及兩者的混合菌液VP+BT注射感染和浸泡感染健康對蝦，病蝦均能產生與對蝦自然發病的HPNS癥狀：攝食減少或不攝食，肝胰腺萎縮，B、F、Ｒ細胞壞死(圖4)。
圖4副溶血弧菌VP和蘇云金芽孢桿菌BT感染對蝦組織病理觀察
a：蘇云金芽孢桿菌BT浸泡感染對蝦的肝胰腺組織切片觀察；b：副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌混合菌浸泡感染對蝦的肝胰腺組織切片觀察；c：副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌混合菌注射感染對蝦的肝胰腺組織切片觀察
3討論
有報道采用PCR方法證明WSSV、YHV、IMNV和TSV等對蝦病毒不是EMS的病因。在本研究中我們運用PCR方法檢測HPNS病蝦11種對蝦病毒，只有WSSV和IHHNV2種病毒可檢測出，但病毒人工感染對蝦并沒有產生HPNS。因此對蝦HPNS不是由單一病毒引起的。
為了確定HPNS產生是否與細菌有關，我們采集63尾HPNS病蝦進行細菌分離鑒定，細菌可以從每一尾對蝦的肝胰腺、血淋巴和腸道分離，經鑒定，這些細菌屬于10個屬，沒有單一的一種細菌可以從所有63尾HPNS病蝦中分離。比如，副溶血弧菌只從其中的38尾對蝦中分離到，蠟樣芽孢桿菌從其中34尾對蝦中分離到，蘇云金芽孢桿菌從其中20尾對蝦分離到，霍亂弧菌從其中19尾對蝦分離到。我們選擇副溶血弧菌和蘇云金芽孢桿菌人工感染健康對蝦，所有發病對蝦均表現HPNS癥狀。結果表明HPNS產生與多種細菌種類有關。
為什么HPNS產生會與多種細菌有關呢?我們認為這要歸結于水體理化因子和有毒藻類的脅迫。HPNS爆發與水體理化因子(如氨氮，亞硝酸鹽等)密切相關。在氨和亞硝酸鹽濃度較高的養殖池塘越容易爆發HPNS感染。如果爆發HPNS疾病，減料停料可以有效降低養殖水體氨氮濃度并有效控制疾病的產展(未發表數據)。如果養殖池塘有毒藻類爆發，HPNS也會產生(未發表數據)。在對蝦養殖中，減料和/或減少養殖密度將降低HPNS爆發的風險，而且對蝦和不同魚類(羅非魚、草魚、胡子鯰等)混養可以有效改善養殖環境并且降低HPNS爆發的風險(未發表數據)。因此，我們認為對蝦養殖生態系統平衡被打破是HPNS爆發的根本原因，養殖生態系統紊亂，導致條件致病菌大量產生和氨氮脅迫，對蝦處于亞健康狀態，多種細菌包括在非脅迫條件下不能感染對蝦的細菌也可以感染對蝦。環境脅迫及導致條件致病菌繁生的生態系統是對蝦發生HPNS的根本原因。